Résistance de P. Falciparum à l'artémisinine au Vietnam

3.1 Conception de l'étude Cette étude est conçue comme une étude de suivi randomisée en ouvert de 42 jours pour évaluer les réponses cliniques et parasitologiques après le traitement des infections à P. falciparum non compliquées avec AS ou DHA-PPQ. Les patients symptomatiques avec des mono-infections à P.falciparum, remplissant les critères de l'étude, seront inclus dans l'étude, randomisés dans l'un des bras de traitement et suivis pendant 42 jours. Toutes les administrations de médicaments seront directement observées et les patients seront activement suivis pendant 42 jours selon un protocole étendu de l'OMS. À la fin de la période de suivi, tous les patients porteurs de gamétocytes seront traités avec une dose unique de primaquine (0,75 mg/kg) conformément aux directives nationales.

3.2. Site et population de l'étude L'étude sera menée dans le district de Krong Pa, province de Gia Lai, où les incidences du paludisme à P.falciparum et à P.vivax sont les plus élevées du pays. L'étude sera située dans la commune de Chu R'Cam où l'équipe de l'étude travaillera avec le personnel de santé local et tous les centres de santé des communes environnantes accueillant des patients atteints de paludisme.

La population locale est principalement composée de la minorité ethnique Gia Rai dont les principales occupations consistent en l'agriculture sur brûlis (principalement du maïs, du manioc et du riz) dans les champs forestiers, ainsi que le travail saisonnier dans les plantations de caoutchouc et la production à petite échelle de biens de consommation courante. subsistance ou commerce, par ex. café et noix de cajou. Le climat est tropical avec une saison sèche de novembre à avril et une saison des pluies de mai à octobre. La zone est vallonnée et boisée (forêt secondaire) et le principal vecteur du paludisme est Anopheles dirus.

3.4. Population de l'essai La population cible comprend tous les patients infectés par P. falciparum qui se présentent spontanément au CSC ou qui sont référés par le personnel de santé des CSC environnants.

3.5. Procédures d'essai 3.5.1 Dépistage. Tous les patients consultant qui répondent aux critères d'inscription de base lors du dépistage se verront attribuer un numéro de dépistage consécutif et seront évalués plus en profondeur par le médecin. Une fois que le patient répond à tous les critères d'inscription, il lui sera demandé (ou un parent ou tuteur dans le cas d'enfants) son consentement à participer à l'étude et un numéro d'étude (ID = numérotation séquentielle) lui sera attribué. Toute personne qui décide de ne pas participer à l'étude sera examinée, traitée et suivie par le personnel de l'établissement de santé selon la norme de soins établie par le ministère de la Santé.

3.5.2. Randomisation et allocation de traitement La randomisation sera effectuée par blocs de 10 avec un ratio d'allocation de 1:1.

Lors de l'inscription, le patient sera interrogé et examiné physiquement et un questionnaire précodé standardisé sera rempli. Un échantillon de sang veineux sera prélevé dans des tubes Vacutainer stériles contenant de l'EDTA ou de l'acide-citrate-dextrose (EDTA/ACD) de tous les patients lors de l'inscription. Un minimum de 5 ml de sang - et un maximum de 8 ml - sera prélevé sur les adultes, et 1 ml/kg jusqu'à 5 ml sera prélevé sur les enfants. Deux gouttes de sang seront ajoutées dans un tube de 1,5 ml contenant 500 µL de réactif RNAprotect (Qiagen).

3.5.3 Traitement Tous les patients recevront un traitement complet d'AS seul (4 mg/kg/jour) ou de DHA-PPQ (dose cible DHA = 4 mg/kg/jour) pendant 3 jours afin d'évaluer la clairance parasitaire précoce. Une cure de 3 jours de SA étant insuffisante pour traiter P.falciparum, elle sera complétée par une cure supplémentaire de 3 jours de DHA-PPQ selon les recommandations de l'OMS. Les patients seront observés pendant 60 minutes après le traitement pour des effets indésirables ou des vomissements. Les patients qui vomissent leur médicament dans les 30 premières minutes recevront une dose complète répétée ; ceux qui vomissent de 30 à 60 minutes recevront une demi-dose.

Des médicaments de secours seront administrés conformément aux directives nationales :

Médicament oral de secours : quinine (30 mg/kg/jour) et clindamycine (15 mg/kg/jour) pendant 7 jours ; Médicament IV de secours : quinine (30 mg/kg/jour) et doxycycline (3 mg/kg/jour) pendant 7 jours 3.5.4. Suivi Du jour 0 jusqu'à la clairance parasitaire : après l'administration de la première dose de médicament antipaludique et observé pendant une heure, les patients seront surveillés toutes les 12 heures par microscopie sanguine au moins jusqu'au jour 3 et plus si nécessaire jusqu'à la clairance parasitaire définie comme deux diapositives négatives consécutives. A chaque visite, le patient sera interrogé et examiné physiquement, le formulaire de suivi complété et tout événement indésirable documenté. Un échantillon de sang par piqûre au doigt sera prélevé pour les résultats suivants : deux lames de sang pour l'observation LM (film épais et mince), 200 µl de sang dans un tube microtainer EDTA/ACD pour une extraction ultérieure de l'ADN, et 2 gouttes de sang dans un autre microtainer tube contenant RNAprotect pour une extraction ultérieure de l'ARN. Une goutte de sang supplémentaire sera prélevée au jour 3 pour mesurer la concentration d'Hb.

Jour 7, 14, 21, 28, 35, 42 Les patients seront ensuite invités à se présenter à la clinique (ou à être visités à domicile) pour chaque visite de suivi, au cours de laquelle ils seront interrogés et examinés, la fiche de suivi sera être rempli et tout événement indésirable documenté. Un échantillon de sang par piqûre au doigt sera prélevé pour les résultats suivants : deux lames de sang pour l'observation LM (film épais et mince), 200 μl de sang dans un tube microtainer EDTA/ACD pour l'extraction d'ADN et 2 gouttes de sang dans un tube microtainer contenant de l'ARNprotect . Aux jours 7, 14, 28 et 42, une goutte de sang sera prélevée pour la concentration en Hb (Hemocue).

Jour de la récidive de P. falciparum La récidive est définie comme toute parasitémie à P. falciparum détectée par l'examen LM pendant la période de suivi du patient et après la clairance parasitaire initiale. Si la récidive est confirmée, un autre échantillon de sang veineux sera prélevé (minimum 5 ml/maximum 8 ml) avant l'administration du traitement de secours : des tests ex-vivo seront effectués avec une partie du sang tandis que le reste sera cryoconservé pour de futures investigations sur la résistance aux médicaments. mécanismes.

3.5.5. Perdus de vue et violations du protocole Il y a perte de suivi lorsque, malgré tous les efforts raisonnables, un patient inscrit ne se présente pas aux visites prévues et est introuvable. Aucun résultat de traitement ne sera attribué à ces patients. Ces patients seront classés comme perdus de vue et censurés ou exclus de l'analyse. Les patients de l'étude qui répondent à l'un des critères suivants seront classés comme retirés : i) retrait du consentement ; ii) non-achèvement du traitement ; iii) violation de l'inscription ; iv) violation volontaire du protocole ; v) violation involontaire du protocole.

3.5.6 Procédures de laboratoire et évaluation Microscopie : trois lames (films minces, épais et minces) doivent être obtenues lors du dépistage. Une lame sera colorée rapidement (10 % de Giemsa pendant 15 min) pour le dépistage initial. Une fois le patient inscrit, les deux autres lames seront colorées plus soigneusement (3 % de Giemsa pendant 45 min). La densité parasitaire sera déterminée en comptant le nombre de parasites asexués pour 200 globules blancs (WBC) avec un compteur manuel. Si plus de 500 parasites ont été comptés avant d'atteindre 200 globules blancs, le comptage sera arrêté après la fin du champ. La densité, qui sera exprimée en nombre de parasites asexués par µl de sang, sera calculée en divisant le nombre de parasites asexués par le nombre de globules blancs comptés et corrigé par la densité de globules blancs estimée (typiquement 8000 par µl). Lorsque le nombre de parasites asexués est inférieur à 10 pour 200 globules blancs dans les frottis de suivi, le comptage sera effectué sur au moins 500 globules blancs. Une lame de sang sera considérée comme négative lorsque l'examen de 1000 globules blancs ne révèle aucun parasite asexué. La densité de gamétocytes sera calculée en comptant le nombre de gamétocytes pour 500 globules blancs.

La concentration d'hémoglobine (Hb) sera mesurée sur du sang total prélevé dans une microcuvette à l'aide d'Hemocue en suivant les instructions du fabricant.

Détection moléculaire de P. falciparum : L'ADN sera extrait d'échantillons de sang prélevés par piqûre au doigt dans des microconteneurs. La confirmation moléculaire des espèces de Plasmodium (P.vivax, P.falciparum, P.ovale et P.malariae) au jour 0 sera effectuée par qPCR ciblant le gène ribosomal 18S. La même méthode qPCR sera utilisée pour identifier et quantifier les infections à P. falciparum au jour 0 et suivre les échantillons.

Génotypage de P. falciparum pour la recrudescence/nouvelle infection : le génotypage des infections récurrentes sera effectué en caractérisant MSP1, MSP2 et GLURP, gènes à copie unique dans le génome de Plasmodium falciparum, comme décrit ailleurs.

Extraction d'ARN et RT-qPCR pour les gamétocytes : l'ARN sera extrait d'échantillons RNAprotect à l'aide de colonnes d'affinité et d'une digestion par ADNase de l'ADN génomique. Pour détecter et quantifier les stades des gamétocytes de P. falciparum, une qPCR de transcription inverse (RT-qPCR) ciblant les transcrits du gène Pfs25 sera effectuée au jour 0 et dans tous les échantillons de suivi, en suivant les protocoles décrits précédemment avec des modifications.

Tests de sensibilité aux médicaments ex vivo : le sang veineux prélevé dans des tubes EDTA/ACD (au jour 0 et au jour de la récidive) sera traité dans les 6 heures suivant le prélèvement. Le sang sera centrifugé et le plasma et le buffy coat seront retirés et stockés à -20°C. Les globules rouges seront lavés deux fois dans du RPMI et remis en suspension dans un milieu de culture (milieu liquide RPMI 1640 LPLF) dans un mélange de milieu sanguin à 50 % d'hématocrite (BMM).

Essai standard de sensibilité aux médicaments ex vivo : l'évaluation suivra les directives de l'OMS "Application sur le terrain d'essais in vitro pour la sensibilité des parasites du paludisme humain aux médicaments antipaludiques" pour l'évaluation de la réponse de P. falciparum aux artémisinines".

Tests ex vivo de survie au stade anneau (RSA) En plus des tests ex vivo standard, la performance des tests de survie au stade anneau (RSA) sera explorée selon un protocole publié.

Marqueurs moléculaires de la résistance à l'artémisinine : l'ADN extrait sera utilisé pour génotyper des mutations ponctuelles dans le domaine de l'hélice de P. falciparum Kelch (K13), qui ont été récemment identifiées comme marqueurs moléculaires de résistance candidats pour la résistance à l'artémisinine. En bref, K13 sera amplifié dans une PCR nichée en utilisant des amorces décrites dans la procédure WWARN INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Après confirmation par électrophorèse sur gel d'agarose, les produits seront séquencés et analysés pour identifier les polymorphismes. Des candidats alternatifs à venir pour la résistance à l'artémisinine peuvent également être explorés. 4. ASSURANCE QUALITÉ Des visites de contrôle du site seront programmées sur une base régulière. Au cours de ces visites, les informations enregistrées sur les formulaires de rapport de cas (CRF) seront vérifiées par rapport aux documents sources (par exemple, les dossiers de laboratoire et les registres de la clinique). Une fois les formulaires CRF rassemblés à la fin de l'essai, ils seront examinés pour s'assurer qu'ils sont complets et exacts. Les données seront saisies deux fois sur place dans une base de données électronique (Epi Info), où des vérifications informatiques spécialement conçues sont utilisées pour identifier les écarts de saisie des données, les plages de données invalides et la cohérence globale. Toutes les divergences seront résolues en se référant aux formulaires originaux de collecte de données vérifiés.

Tous les frottis sanguins à l'admission seront lus sur le site de l'étude ainsi que par un microscopiste senior dans un centre de coordination. De plus, un contrôle qualité externe sera effectué à l'IMT sur 10% des lames sélectionnées au hasard. Pour chacun des tests moléculaires (qPCR, RT-qPCR et génotypage parasitaire) 10% des échantillons traités au NIMPE seront choisis au hasard pour être ré-analysés à l'IMT. Le contrôle externe de la qualité des résultats des analyses de médicaments ex vivo sera effectué à l'IMT où les lames seront réexaminées pour 10 % des isolats choisis au hasard.

5. Plan d'analyse statistique Le temps de clairance parasitaire est défini comme le temps écoulé (en heures) entre le moment du traitement du patient (première dose) et le premier de deux lames de sang négatives consécutives. Le temps et le taux d'élimination des parasites ainsi que la phase de latence seront ajustés à l'aide de l'outil en ligne PCE développé par WWARN. L'analyse du taux de guérison à 42 jours sera effectuée à la fois pour la population de patients en intention de traiter modifiée (mITT) (tous les patients randomisés) et pour la population de patients évaluables (per protocole). Les patients sont évaluables pour l'analyse du taux de guérison à 28/42 jours si le nombre de parasites est enregistré jusqu'au jour 26/40 ou si le patient arrête en raison d'un « effet thérapeutique insatisfaisant » en raison de la réapparition de parasites. L'analyse mITT inclut également les patients qui arrêtent avant le jour 28/42 pour des raisons autres que « Effet thérapeutique insatisfaisant » (par exemple, cela pourrait inclure « Expérience(s) indésirable(s) » en raison de vomissements répétés). Ces patients seront comptés dans l'analyse mITT comme des échecs thérapeutiques, quelle que soit la raison de leur arrêt. Les patients qui ont eu un traitement concomitant avec des antibiotiques ayant un effet antipaludéen seront exclus des patients évaluables et inclus dans le mITT.

Pour les variables catégorielles, les pourcentages et les intervalles de confiance à 95 % correspondants seront calculés à l'aide de la méthode de Wilson. Les proportions seront comparées en calculant le *2 avec la correction de Yates ou par le test exact de Fisher le cas échéant. Les données continues normalement distribuées seront résumées sous forme de moyennes et d'écarts types, et comparées par le test t de Student et l'analyse de la variance. Les données non conformes à une distribution normale seront résumées sous forme de médianes (IQR) ou de moyennes géométriques et comparées par le test U de Mann-Whitney ou l'analyse de variance de Kruskal-Wallis. L'association entre 2 variables continues sera évaluée à l'aide du coefficient de corrélation de rang de Spearman.

Le risque d'échec du traitement aux jours 28 et 42 sera tous évalué par une analyse de survie avec des incidences cumulées calculées par la méthode de Kaplan Meier et comparées par le test du log-rank de Mantel-Haenszel.

Les temps d'élimination des parasites, de la fièvre et des gamétocytes seront également évalués par la méthode de Kaplan Meier.

Les changements hématologiques au cours de la première semaine de traitement ainsi que la récupération au cours du suivi hebdomadaire seront évalués en mesurant les changements de concentration d'Hb entre les jours 0, 3, 7 et les jours 14, 28 et 42, respectivement.

6. QUESTIONS ÉTHIQUES Autorisations éthiques L'autorisation éthique pour mener l'étude aura été obtenue auprès du comité d'éthique de l'Institut national de paludologie, de parasitologie et d'entomologie de Hanoï et de l'Université d'Anvers, ainsi que du comité d'examen institutionnel de l'IMT. , Anvers.

Consentement éclairé Les patients ne seront inclus dans l'étude que s'ils (ou les parents ou tuteurs des enfants) donnent leur consentement éclairé. La demande de consentement est disponible en anglais et traduite en vietnamien sera lue entièrement au patient, parent ou tuteur. Des détails sur l'essai, ses avantages et ses risques potentiels seront expliqués. Une fois que toutes les questions auront été répondues, une signature sera demandée sur le document. Si le patient est analphabète, un témoin alphabétisé doit signer ; si possible, le signataire sera choisi par le participant et n'aura aucun lien avec l'équipe de recherche.