P. Falciparum Artemisinin-rezisztencia Vietnamban

3.1 A vizsgálat felépítése Ezt a vizsgálatot randomizált, nyílt elrendezésű, 42 napos követési vizsgálatként tervezték, hogy értékeljék a klinikai és parazitológiai válaszokat a szövődménymentes P. falciparum fertőzések AS-val vagy DHA-PPQ-val történő kezelése után. A P. falciparum monofertőzésben szenvedő, tünetmentes, a vizsgálati kritériumokat teljesítő betegeket bevonják a vizsgálatba, véletlenszerűen besorolják az egyik kezelési karba, és 42 napig követik őket. Minden gyógyszerbeadást közvetlenül megfigyelnek, és a betegeket 42 napon keresztül aktívan nyomon követik a WHO kiterjesztett protokollja szerint. A követési idő végén minden gametocitát hordozó beteget egyetlen adag Primaquine-nal (0,75 mg/kg) kezelnek a nemzeti irányelvek szerint.

3.2. A vizsgálat helyszíne és populációja A vizsgálatot a Gia Lai tartomány Krong Pa körzetében végzik, ahol a P. falciparum és a P. vivax malária előfordulása a legmagasabb az országban. A tanulmány a Chu R'Cam kommunában lesz, ahol a kutatócsoport a helyi egészségügyi személyzettel és a környező települések egészségügyi központjaival fog együtt dolgozni, ahol maláriás betegek találhatók.

A helyi lakosságot főként a Gia Rai etnikai kisebbség alkotja, akiknek fő foglalkozása a mezőgazdaság (főleg a kukorica, a manióka és a rizs) erdei szántóföldeken, valamint a gumiültetvényeken végzett szezonális munka, valamint a napi áruk kisüzemi termelése. megélhetés vagy kereskedelem pl. kávé és kesudió. Az éghajlat trópusi, a száraz évszak novembertől áprilisig, az esős évszak pedig májustól októberig tart. A terület dombos és erdős (másodlagos erdő), és a malária fő hordozója az Anopheles dirus.

3.4. Vizsgálati populáció A célpopuláció magában foglalja az összes P. falciparum fertőzött beteget, aki vagy spontán jelentkezik a CHC-be, vagy a környező CHC egészségügyi személyzete utalja be őket.

3.5. Próba eljárások 3.5.1 Szűrés. Minden konzultáns beteg, aki megfelel a szűrés során az alapvető felvételi kritériumoknak, egy egymást követő szűrési számot kap, és az orvos alaposabban értékeli. Amint a beteg megfelel az összes felvételi kritériumnak, tőle (vagy gyermek esetén szülőjétől vagy gyámjától) beleegyezését kell kérni a vizsgálatban való részvételhez, és vizsgálati számot kap (azonosító = sorszámozás). Minden olyan személyt, aki úgy dönt, hogy nem vesz részt a vizsgálatban, az egészségügyi intézmény személyzete megvizsgálja, kezeli és nyomon követi az Egészségügyi Minisztérium által meghatározott ellátási színvonalnak megfelelően.

3.5.2. Randomizálás és kezelés kiosztása A véletlenszerűsítés 10-es blokkokban történik, 1:1 allokációs arány mellett.

A beiratkozáskor a pácienst kihallgatják és fizikálisan megvizsgálják, valamint szabványos, előre kódolt kérdőívet töltenek ki. A vénás vérmintát EDTA-t vagy sav-citrát-dextrózt (EDTA/ACD) tartalmazó steril vacutainer csövekbe veszik a felvételkor minden betegtől. Felnőttektől minimum 5 ml - maximum 8 ml - vért, gyermekektől 1 ml/kg-ot 5 ml-ig. Két vércseppet csepegtetünk egy 1,5 ml-es csőbe, amely 500 µl RNAprotect reagenst (Qiagen) tartalmaz.

3.5.3 Kezelés Minden beteg teljes körű kezelést kap vagy önmagában AS-vel (4 mg/ttkg/nap) vagy DHA-PPQ-val (céldózis DHA=4mg/kg/nap) 3 napon keresztül a parazita korai kiürülésének értékelése érdekében. Mivel a 3 napos AS-kúra nem elegendő a P. falciparum kezelésére, a WHO ajánlásainak megfelelően egy további 3 napos DHA-PPQ kezeléssel egészül ki. A betegeket a kezelés után 60 percig megfigyelik a mellékhatások vagy a hányás szempontjából. Azok a betegek, akik az első 30 percben hányják a gyógyszerüket, ismételt teljes adagot kapnak; a 30-60 perctől hányók fél adagot kapnak.

A mentőgyógyszereket a nemzeti irányelvek szerint adják:

Mentő orális gyógyszer: kinin (30mg/ttkg/nap) és klindamicin (15mg/kg/nap) 7 napig; Mentő IV gyógyszer: kinin (30 mg/ttkg/nap) és doxiciklin (3 mg/kg/nap) 7 napig 3.5.4. Nyomon követés a 0. naptól a parazita kiürüléséig: a malária elleni gyógyszer első adagjának beadása és egy órás megfigyelése után a betegeket 12 óránként vérmikroszkóppal ellenőrizni fogják, legalább a 3. napig, és szükség esetén tovább is, amíg a parazita kiürülése 2. egymást követő negatív diák. Minden vizit alkalmával a pácienst kihallgatják és fizikailag megvizsgálják, kitöltik a nyomon követési űrlapot, és dokumentálnak minden nemkívánatos eseményt. Ujjszúrt vérmintát veszünk a következő eredményekhez: két vérlemez LM megfigyeléshez (vastag és vékony film), 200 µl vér egy EDTA/ACD mikrotainer csőbe későbbi DNS-kivonás céljából, és 2 csepp vér egy másik mikrotainerbe. RNAprotectet tartalmazó cső a későbbi RNS extrakcióhoz. A 3. napon további csepp vért vesznek a Hb-koncentráció mérésére.

7., 14., 21., 28., 35., 42. nap A betegeket ezután felkérik, hogy minden egyes utóellenőrzési látogatás alkalmával jelenjenek meg a klinikán (vagy otthon látogassák meg őket), amely során interjút készítenek és megvizsgálnak. ki kell tölteni, és minden nemkívánatos eseményt dokumentálni kell. Ujjszúrásos vérmintát veszünk a következő eredményekhez: két vérlemez LM megfigyeléshez (vastag és vékony film), 200 μl vér EDTA/ACD mikrotainer csőben a DNS-kivonáshoz, és 2 csepp vér RNAprotect-et tartalmazó mikrotainer csőben . A 7., 14., 28. és 42. napon egy csepp vért veszünk a Hb-koncentráció meghatározásához (vérzés).

A P. falciparum kiújulásának napja A kiújulás minden olyan P. falciparum parazitémiát jelent, amelyet LM-vizsgálattal észleltek a páciens követési időszaka alatt és a parazita kezdeti eltávolítása után. Ha a kiújulás megerősítést nyer, további vénás vérmintát vesznek (legalább 5 ml/maximum 8 ml) a mentőkezelés beadása előtt: ex vivo vizsgálatokat végeznek a vér egy részével, míg a fennmaradó részt mélyhűtve tárolják a gyógyszerrezisztencia jövőbeni vizsgálata céljából. mechanizmusok.

3.5.5. A nyomon követés és a protokoll megsértése miatti veszteség A nyomon követés hiánya akkor következik be, ha minden ésszerű erőfeszítés ellenére a beíratott beteg nem jelenik meg a tervezett viziteken, és nem található. Ezekhez a betegekhez nem rendelnek hozzá kezelési eredményt. Ezeket a betegeket a nyomon követés miatt elveszettnek minősítik, és cenzúrázzák vagy kizárják az elemzésből. Azok a vizsgálati betegek, akik megfelelnek az alábbi kritériumok bármelyikének, visszavontnak minősülnek: i) a beleegyezés visszavonása; ii) a kezelés befejezésének elmulasztása; iii) beiratkozási szabálysértés; iv) önkéntes protokollsértés; v) akaratlan protokollsértés.

3.5.6 Laboratóriumi eljárások és értékelés Mikroszkópia: három tárgylemezt (vékony és vastag és vékony filmet) kell venni a szűréskor. Egy tárgylemezt gyorsan megfestenek (10% Giemsa 15 percig) a kezdeti szűréshez. Miután a pácienst bevonták, a másik két tárgylemezt alaposabban megfestik (3% Giemsa 45 percig). A parazita sűrűségét a 200 fehérvérsejtre (WBC) jutó aszexuális paraziták számának kézi számlálóval történő megszámlálásával kell meghatározni. Ha több mint 500 parazitát számláltak meg a 200 WBC elérése előtt, a számlálást leállítják a mező kitöltése után. A sűrűséget az aszexuális paraziták µl vérenkénti számában fejezzük ki, és az aszexuális paraziták számát elosztjuk a megszámlált fehérvérsejtek számával, és korrigáljuk a becsült WBC-sűrűséggel (jellemzően 8000/µl). Ha az ivartalan paraziták száma kevesebb, mint 10/200 fehérvérsejt az utóellenőrzési kenetekben, a számlálást legalább 500 fehérvérsejthez képest végezzük. A vérlemez akkor tekinthető negatívnak, ha 1000 fehérvérsejt vizsgálata nem tár fel aszexuális parazitákat. A gametociták sűrűségét úgy számítjuk ki, hogy megszámoljuk az 500 WBC-nkénti gametociták számát.

A hemoglobin (Hb) koncentrációt a Hemocue segítségével mikroküvettába gyűjtött teljes véren mérik a gyártó utasításait követve.

P. falciparum molekuláris kimutatás: a DNS-t mikrotainerekben gyűjtött ujjszúrt vérmintákból vonják ki. A Plasmodium fajok (P.vivax, P.falciparum, P.ovale és P.malariae) molekuláris megerősítését a 0. napon a 18S riboszomális gént megcélzó qPCR-rel végezzük. Ugyanezt a qPCR-módszert fogják használni a P. falciparum fertőzések azonosítására és számszerűsítésére a 0. napon, valamint a minták nyomon követésére.

P. falciparum genotipizálás kiújulás/új fertőzés esetén: a visszatérő fertőzések genotipizálása a Plasmodium falciparum genomjában található egymásolatú MSP1, MSP2 és GLURP gének jellemzésével történik, a másutt leírtak szerint.

RNS extrakció és RT-qPCR gametocitákhoz: Az RNS-t az RNAprotect mintákból affinitásoszlopokkal és a genomiális DNS DNS-ázzal történő emésztésével vonják ki. A P. falciparum gametocita stádiumainak kimutatására és mennyiségi meghatározására a Pfs25 gén transzkriptumokat célzó reverz transzkripciós qPCR (RT-qPCR) elvégzése a 0. napon és az összes nyomon követési mintában történik, a korábban leírt, módosításokkal kiegészített protokollokat követve.

Ex vivo gyógyszerérzékenységi vizsgálatok: EDTA/ACD csövekbe gyűjtött vénás vért (a 0. napon és a kiújulás napján) a levétel után 6 órán belül feldolgozzák. A vért centrifugálják, a plazmát és a buffy coat-ot eltávolítják, és -20 °C-on tárolják. A vörösvértesteket kétszer mossuk RPMI-ben, és tenyésztőközegben (RPMI 1640 LPLF folyékony táptalaj) 50%-os hematokrit tartalmú vértápközeg keverékben (BMM) újraszuszpendáljuk.

Szabványos ex vivo gyógyszerérzékenységi vizsgálat: az értékelés a WHO „A humán maláriaparaziták maláriaellenes gyógyszerekkel szembeni érzékenységének in vitro vizsgálatának helyszíni alkalmazása” című WHO-irányelveit követi a P. falciparum artemisininekre adott válaszának értékelésére.

Ex vivo gyűrűstádiumú túlélési vizsgálatok (RSA) A standard ex vivo vizsgálatokon túlmenően a gyűrűstádiumú túlélési tesztek (RSA) teljesítményét is megvizsgáljuk egy közzétett protokoll alapján.

Az artemisininrezisztencia molekuláris markerei: a kivont DNS-t a P. falciparum Kelch propeller doménjének (K13) pontmutációinak genotipizálására fogják használni, amelyeket a közelmúltban az artemisinin rezisztencia jelölt rezisztencia molekuláris markereiként azonosítottak. Röviden, a K13-at egy beágyazott PCR-ben amplifikáljuk az INV11 WWARN eljárásban [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures] leírt primerek használatával. Az agaróz gél elektroforézis megerősítése után a termékeket szekvenálják és elemzik a polimorfizmusok azonosítása érdekében. 4. MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS A helyszíni monitoring látogatásokat rendszeres időközönként tervezik. E látogatások során az esetjelentési űrlapokon (CRF) rögzített információkat forrásdokumentumokhoz (pl. laboratóriumi nyilvántartásokhoz és klinikai nyilvántartásokhoz) hasonlítják össze. Miután a CRF-űrlapokat a próba végén összegyűjtötték, teljességük és pontosságuk szempontjából felülvizsgáljuk őket. Az adatok a helyszínen kétszer kerülnek be egy elektronikus adatbázisba (Epi Info), ahol speciálisan kialakított számítógépes ellenőrzések segítségével azonosítják az adatbeviteli eltéréseket, az érvénytelen adattartományokat és az általános konzisztenciát. Minden eltérést az eredeti ellenőrzött adatgyűjtési űrlapokra hivatkozva oldunk fel.

A felvételkor felvett összes vérfilmet a vizsgálat helyszínén, valamint a koordinációs központ vezető mikroszkópos szakembere fogja felolvasni. Ezenkívül a véletlenszerűen kiválasztott diák 10%-án külső minőségellenőrzést végeznek az ITM-nél. Minden egyes molekuláris vizsgálathoz (qPCR, RT-qPCR és parazita genotipizálás) a NIMPE-nél feldolgozott minták 10%-át véletlenszerűen választják ki az ITM-en történő újraelemzésre. Az ex vivo gyógyszervizsgálati eredmények külső minőségellenőrzésére az ITM-ben kerül sor, ahol a lemezeket újra megvizsgálják a véletlenszerűen kiválasztott izolátumok 10%-ára.

5. Statisztikai elemzési terv A parazita kiürülési ideje a beteg kezelésétől (első adag) a két egymást követő negatív vérlemez közül az elsőig eltelt idő (órákban). A paraziták eltávolításának idejét és sebességét, valamint a késleltetési fázist a WWARN által kifejlesztett PCE online eszköz segítségével rögzítik. A 42 napos gyógyulási arány elemzése mind a módosított kezelési szándékú (mITT) betegpopulációra (minden randomizált beteg), mind az értékelhető betegpopulációra (Protokollonként) kerül sor. A betegek értékelhetők a 28/42 napos gyógyulási arány elemzéséhez, ha a parazitaszámot a 26/40. napig rögzítik, vagy a beteg a "nem kielégítő terápiás hatás" miatt a paraziták újbóli megjelenése miatt abbahagyja a kezelést. Az mITT-elemzésbe azok a betegek is beletartoznak, akik a 28/42. nap előtt a „Nem kielégítő terápiás hatás”-on kívüli okok miatt hagyták abba a kezelést (például idetartozhatnak a „Káros tapasztalatok” ismétlődő hányás miatt). Ezek a betegek a kezelés megszakításának okától függetlenül a kezelés sikertelenségének számítanak az mITT elemzésben. Azokat a betegeket, akik egyidejűleg maláriaellenes hatású antibiotikumokkal kezeltek, kizárják az értékelhető betegek közül, és bekerülnek a mITT-be.

Kategorikus változók esetén a százalékokat és a megfelelő 95%-os konfidencia intervallumokat a Wilson-módszerrel számítjuk ki. Az arányokat úgy kell összehasonlítani, hogy a *2-t Yates korrekciójával vagy Fisher-féle pontos teszttel kell kiszámítani, ahol ez szükséges. A normál eloszlású folytonos adatokat átlagokként és szórásokként összegzik, majd Student-féle t-próbával és varianciaanalízissel hasonlítják össze. A normál eloszlásnak nem megfelelő adatokat mediánként (IQR) vagy geometriai átlagként összegzik, és a Mann-Whitney U-teszttel vagy a Kruskal-Wallis varianciaanalízissel hasonlítják össze. A két folytonos változó közötti összefüggést a Spearman-féle rangkorrelációs együttható segítségével értékeljük.

A kezelés sikertelenségének kockázatát a 28. és a 42. napon túlélési elemzéssel értékelik, a Kaplan Meier-módszerrel számított kumulatív előfordulási gyakorisággal, és összehasonlítják a Mantel-Haenszel log rank teszttel.

A paraziták, a láz és a gametociták kiürülési idejét a Kaplan Meier módszerrel is értékeljük.

A kezelés első hetében bekövetkezett hematológiai változásokat, valamint a heti utánkövetés során bekövetkezett gyógyulást a Hb-koncentráció 0., 3., 7., illetve 14., 28. és 42. nap közötti változásának mérésével értékelik.

6. ETIKAI KÉRDÉSEK Etikai engedélyek A vizsgálat elvégzéséhez szükséges etikai engedélyt a Hanoi Nemzeti Malariológiai, Parazitológiai és Rovartani Intézet etikai bizottsága, valamint az Antwerpeni Egyetem, valamint az ITM Intézményi Ellenőrző Testülete szerezte be. , Antwerpen.

Tájékozott beleegyezés A betegek csak akkor vehetők részt a vizsgálatban, ha ők (vagy a gyermekek szülei vagy gyámjai) tájékozott beleegyezésüket adják. A beleegyezési kérelem angol nyelven áll rendelkezésre, és vietnami nyelvre lefordítva teljes egészében a páciens, a szülő vagy a gyám számára olvasható. A kísérlet részleteit, annak előnyeit és lehetséges kockázatait ismertetjük. A kérdések megválaszolása után aláírást kérnek a dokumentumon. Ha a beteg írástudatlan, írástudó tanúnak kell aláírnia; ha lehetséges, az aláírót a résztvevő választja ki, és nem lesz kapcsolata a kutatócsoporttal.