越南恶性疟原虫对青蒿素的抗性

3.1 研究设计 本研究设计为随机开放标签 42 天随访研究，以评估用 AS 或 DHA-PPQ 治疗无并发症的恶性疟原虫感染后的临床和寄生虫学反应。 符合研究标准的恶性疟原虫单一感染的有症状患者将被纳入研究，随机分配到其中一个治疗组并随访 42 天。 将直接观察所有药物管理，并根据扩展的 WHO 协议对患者进行 42 天的积极随访。 在随访时间结束时，所有携带配子体的患者都将按照国家指南接受单剂量伯氨喹 (0.75mg/kg) 治疗。

3.2. 研究地点和人口 该研究将在嘉莱省 Krong Pa 区进行，那里的恶性疟原虫和间日疟原虫疟疾发病率在该国最高。 该研究将位于 Chu R'Cam 公社，研究小组将在那里与当地卫生人员和所有周边有疟疾患者的公社卫生中心合作。

当地人口主要由嘉莱少数民族组成，他们的主要职业包括林地刀耕火种（主要是玉米、木薯和水稻），以及橡胶园的季节性工作，以及日常用品的小规模生产生存或贸易，例如 咖啡和腰果。 气候属热带气候，11 月至 4 月为旱季，5 月至 10 月为雨季。 该地区是丘陵和森林（次生林），主要的疟疾媒介是按蚊。

3.4. 试验人群 目标人群包括所有自发到 CHC 或由周围 CHC 的医务人员转诊的恶性疟原虫感染患者。

3.5. 试验程序 3.5.1 筛选。 所有在筛查期间符合基本入组标准的咨询患者将被分配一个连续的筛查编号，并由医生进行更深入的评估。 一旦患者满足所有入组标准，他或她（或儿童的父母或监护人）将被征求同意参与研究，并将被分配一个研究编号（ID = 顺序编号）。 任何决定不参加研究的人将由卫生机构工作人员根据卫生部制定的护理标准进行检查、治疗和随访。

3.5.2. 随机化和治疗分配 随机化将以 10 个为一组进行，分配比例为 1:1。

在登记时，将对患者进行面谈和身体检查，并填写标准化的预编码问卷。 将在入组时将所有患者的静脉血样收集到含有 EDTA 或柠檬酸葡萄糖 (EDTA/ACD) 的无菌真空采血管中。 从成人身上采集最少 5 毫升的血液，最多采集 8 毫升的血液，从儿童身上采集 1 毫升/千克最多 5 毫升的血液。 将两滴血加入含有 500 µL RNAprotect 试剂 (Qiagen) 的 1.5 ml 试管中。

3.5.3 治疗 所有患者将单独接受 AS（4mg/kg/天）或 DHA-PPQ（目标剂量 DHA=4mg/kg/天）的完整治疗 3 天，以评估早期寄生虫清除率。 由于 3 天的 AS 疗程不足以治疗恶性疟原虫，根据 WHO 的建议，将通过额外的 3 天 DHA-PPQ 方案来完成。 治疗后将观察患者 60 分钟是否有不良反应或呕吐。 那些在前 30 分钟内呕吐药物的患者将接受重复的全剂量；呕吐30-60分钟者减半。

救援药物将按照国家指南提供：

抢救口服药物：奎宁（30mg/kg/天）和克林霉素（15mg/kg/天），连用7天；抢救IV药物：奎宁（30mg/kg/天）和多西环素（3mg/kg/天）7天 3.5.4. 从第 0 天到寄生虫清除：在给予第一剂抗疟药并观察一小时后，将通过血液显微镜每 12 小时对患者进行一次监测，至少持续到第 3 天，必要时更长，直到寄生虫清除定义为第 2 天连续下滑。 每次就诊时，都会对患者进行面谈和身体检查，填写随访表并记录任何不良事件。 将采集手指刺血样本以获得以下结果：两张用于 LM 观察的血片（厚膜和薄膜），将 200 微升血液放入 EDTA/ACD 微量容器管中用于稍后提取 DNA，将 2 滴血液放入另一个微量容器中含有 RNAprotect 的试管，用于以后的 RNA 提取。 第 3 天将额外采集一滴血以测量 Hb 浓度。

第 7、14、21、28、35、42 天 每次复诊时，患者将被要求到门诊（或在家中访问），期间他们将接受访谈和检查，随访表将完成，并记录任何不良事件。 将采集手指刺血样本以获得以下结果：两张用于 LM 观察的血玻片（厚膜和薄膜）、200μl 血液在 EDTA/ACD 微量采管中用于 DNA 提取，以及 2 滴血液在含有 RNAprotect 的微量采管中. 在第 7、14、28 和 42 天，将采集一滴血用于 Hb 浓度 (Hemocue)。

恶性疟原虫复发的日期 复发定义为在患者的随访期间和初始寄生虫清除后通过 LM 检查检测到的任何恶性疟原虫寄生虫血症。 如果确认复发，将在进行救援治疗之前收集更多的静脉血样（最少 5ml/最多 8ml）：将对一部分血液进行离体检测，而其余部分将被冷冻保存以用于未来的耐药性调查机制。

3.5.5. 失访和违反协议 当尽管做出了所有合理努力，登记的患者没有参加预定的访视并且找不到时，就会发生失访。 不会为这些患者指定治疗结果。 这些患者将被归类为失访并被审查或排除在分析之外。 符合以下任何标准的研究患者将被归类为退出：i) 退出同意； ii) 未能完成治疗； iii) 违规注册； iv) 自愿违反协议； v) 非自愿违反协议。

3.5.6 实验室程序和评估 显微镜检查：应在筛选时获得三张载玻片（薄片、厚片和薄膜）。 一张载玻片将被快速染色（10% 吉姆萨染色 15 分钟）以进行初步筛选。 患者入组后，将对另外两张载玻片进行更仔细的染色（3% 姬姆萨染色 45 分钟）。 寄生虫密度将通过用手计数计数器计算每 200 个白细胞 (WBC) 中无性寄生虫的数量来确定。 如果在达到 200 个 WBC 之前已经对 500 个以上的寄生虫进行了计数，则在现场完成后将停止计数。 密度将表示为每微升血液中无性寄生虫的数量，计算方法是将无性寄生虫的数量除以计算的白细胞数量，并根据估计的白细胞密度（通常为每微升 8000 个）进行校正。 当后续涂片中无性寄生虫的数量低于每 200 个白细胞 10 个时，将至少对 500 个白细胞进行计数。 当检查 1000 个白细胞未发现无性寄生虫时，血片将被视为阴性。 配子体密度将通过计算每 500 个 WBC 中配子体的数量来计算。

血红蛋白 (Hb) 浓度将按照制造商的说明使用 Hemocue 对收集到微试管中的全血进行测量。

P. falciparum 分子检测：DNA 将从采集在微量容器中的指尖血样中提取。 第 0 天疟原虫物种（P.vivax、P.falciparum、P.ovale 和 P.malariae）的分子确认将通过靶向 18S 核糖体基因的 qPCR 进行。 相同的 qPCR 方法将用于在第 0 天识别和量化恶性疟原虫感染并跟踪样本。

恶性疟原虫复发/新感染的基因分型：复发感染的基因分型将通过表征 MSP1、MSP2 和 GLURP、恶性疟原虫基因组中的单拷贝基因来完成，如别处所述。

配子体的 RNA 提取和 RT-qPCR：将使用亲和柱和基因组 DNA 的 DNAse 消化从 RNAprotect 样品中提取 RNA。 为了检测和量化恶性疟原虫配子体阶段，将在第 0 天和所有后续样本中进行针对 Pfs25 基因转录物的逆转录 qPCR (RT-qPCR)，遵循先前描述的协议并进行修改。

离体药物敏感性测定：收集在 EDTA/ACD 管中的静脉血（在第 0 天和复发日）将在收集后 6 小时内处理。 将血液离心并去除血浆和血沉棕黄层并储存在 -20ºC。 红细胞将在 RPMI 中洗涤两次，并重新悬浮在培养基（RPMI 1640 LPLF 液体培养基）中，成为 50% 血细胞比容血液培养基混合物（BMM）。

标准体外药敏试验：评估将遵循WHO指南《恶性疟原虫抗疟药物敏感性体外试验的现场应用》评估恶性疟原虫对青蒿素的反应。

离体环期存活测定 (RSA) 除了标准的离体测定外，环期存活测定 (RSA) 的性能将按照已发布的方案进行探索。

青蒿素抗性分子标记：提取的 DNA 将用于对恶性疟原虫 Kelch 螺旋桨结构域 (K13) 中的点突变进行基因分型，该结构域最近被确定为青蒿素抗性的候选抗性分子标记。 简而言之，将使用 WWARN 程序 INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures] 中描述的引物在嵌套 PCR 中扩增 K13。 琼脂糖凝胶电泳确认后，对产物进行测序分析，鉴定多态性。 还可以探索其他即将出现的青蒿素抗性候选物 4. 质量保证 将定期安排现场监测访问。 在这些访问期间，记录在病例报告表 (CRF) 上的信息将根据源文件（例如实验室记录和诊所登记册）进行验证。 在试验结束时整理 CRF 表格后，将对其完整性和准确性进行审查。 数据将在现场双重输入电子数据库 (Epi Info)，其中使用专门设计的计算机检查来识别数据输入差异、无效数据范围和整体一致性。 所有差异将通过参考原始检查数据收集表来解决。

所有入院时的血片都将在研究地点以及协调中心的高级显微镜师处读取。 此外，ITM 将对 10% 随机选择的载玻片进行外部质量控制。 对于每项分子检测（qPCR、RT-qPCR 和寄生虫基因分型），将随机选择 10% 在 NIMPE 处理的样本在 ITM 进行重新分析。体外药物检测结果的外部质量控制将在 ITM 进行，在那里将重新检查载玻片以寻找 10% 的随机选择的分离株。

5. 统计分析计划 寄生虫清除时间定义为从患者治疗（第一次给药）时间到连续两次阴性血液载玻片中第一次的经过时间（以小时为单位）。 寄生虫清除时间和速率以及滞后期将使用 WWARN 开发的 PCE 在线工具进行拟合。 将对修改后的意向治疗 (mITT) 患者群体（所有随机分组的患者）和可评估的患者群体（根据方案）进行 42 天治愈率的分析。 如果寄生虫计数记录到第 26/40 天或患者因寄生虫再次出现而导致“治疗效果不理想”而停止治疗，则患者可通过 28/42 天治愈率的分析进行评估。 mITT 分析还包括在第 28/42 天之前因“不满意的治疗效果”以外的原因（例如，这可能包括由于反复呕吐而导致的“不良经历”）而停止治疗的患者。 这些患者将在 mITT 分析中计为治疗失败，而不管他们中止的原因如何。 用具有抗疟疾作用的抗生素伴随治疗的患者将被排除在可评估患者之外并包括在mITT中。

对于分类变量百分比和相应的 95% 置信区间将使用 Wilson 方法计算。 将通过 Yates 修正计算 *2 或在适当情况下通过 Fisher 精确检验来比较比例。 正态分布的连续数据将汇总为均值和标准差，并通过学生 t 检验和方差分析进行比较。 不符合正态分布的数据将汇总为中位数 (IQR) 或几何平均值，并通过 Mann-Whitney U 检验或 Kruskal-Wallis 方差分析进行比较。 将使用 Spearman 等级相关系数评估 2 个连续变量之间的关联。

第 28 天和第 42 天治疗失败的风险将全部通过生存分析进行评估，累积发生率通过 Kaplan Meier 方法计算并通过 Mantel-Haenszel 对数秩检验进行比较。

寄生虫、发烧和配子体清除时间也将通过 Kaplan Meier 方法进行评估。

治疗第一周的血液学变化以及每周随访期间的恢复将分别通过测量第 0、3、7 天和第 14、28 和 42 天之间 Hb 浓度的变化来评估。

6. 伦理问题 伦理许可 进行研究的伦理许可将从河内国家疟疾学、寄生虫学和昆虫学研究所和安特卫普大学的伦理委员会以及 ITM 的机构审查委员会获得, 安特卫普。

知情同意 只有在患者（或儿童的父母或监护人）给予知情同意的情况下，患者才会被纳入研究。 同意请求以英文提供，并翻译成越南语，将完整地读给患者、父母或监护人听。 将解释有关试验及其好处和潜在风险的详细信息。 回答任何问题后，将要求在文档上签名。 如果患者不识字，必须有识字的见证人签字；如果可能，签字人将由参与者选择，与研究团队无关。