P. Falciparum Weerstand tegen artemisinine in Vietnam

3.1 Studieopzet Deze studie is opgezet als een gerandomiseerde open-label follow-upstudie van 42 dagen om de klinische en parasitologische reacties na behandeling van ongecompliceerde P.falciparum-infecties met AS of DHA-PPQ te evalueren. Symptomatische patiënten met mono-infecties met P.falciparum die aan de studiecriteria voldoen, zullen worden opgenomen in de studie, gerandomiseerd naar een van de behandelingsarmen en gedurende 42 dagen worden gevolgd. Alle medicijntoediening wordt direct geobserveerd en de patiënten worden gedurende 42 dagen actief opgevolgd volgens een uitgebreid WHO-protocol. Aan het einde van de follow-upperiode zullen alle patiënten die drager zijn van gametocyten worden behandeld met een enkele dosis Primaquine (0,75 mg/kg) volgens de nationale richtlijnen.

3.2. Onderzoekslocatie en populatie Het onderzoek zal worden uitgevoerd in het district Krong Pa, in de provincie Gia Lai, waar de incidentie van zowel P.falciparum als P.vivax het hoogst is in het land. De studie zal plaatsvinden in de gemeente Chu R'Cam, waar het onderzoeksteam zal samenwerken met het lokale gezondheidspersoneel en alle omliggende gezondheidscentra met malariapatiënten.

De lokale bevolking bestaat voornamelijk uit de Gia Rai-etnische minderheid wiens belangrijkste bezigheden bestaan ​​uit slash and burn-landbouw (voornamelijk maïs, maniok en rijst) in bosvelden, samen met seizoenswerk in rubberplantages en kleinschalige productie van goederen voor dagelijks gebruik. levensonderhoud of handel b.v. koffie en cashewnoten. Het klimaat is tropisch met een droog seizoen van november tot april en het regenseizoen van mei tot oktober. Het gebied is heuvelachtig en bebost (secundair bos) en de belangrijkste malariavector is Anopheles dirus.

3.4. Proefpopulatie De doelpopulatie omvat alle met P. falciparum geïnfecteerde patiënten die ofwel spontaan bij het CHC komen ofwel worden doorverwezen door het gezondheidspersoneel van de omliggende CHC's.

3.5. Proefprocedures 3.5.1 Screening. Alle consulterende patiënten die tijdens de screening aan de basisinschrijvingscriteria voldoen, krijgen een doorlopend screeningsnummer en worden door de arts nader beoordeeld. Zodra de patiënt aan alle inschrijvingscriteria voldoet, zal hij of zij (of een ouder of voogd in het geval van kinderen) om toestemming worden gevraagd om deel te nemen aan de studie en zal hij of zij een studienummer toegewezen krijgen (ID=doorlopende nummering). Elke persoon die besluit niet deel te nemen aan het onderzoek zal worden onderzocht, behandeld en opgevolgd door het personeel van de gezondheidsinstelling volgens de zorgstandaard die is vastgesteld door het ministerie van Volksgezondheid.

3.5.2. Randomisatie en behandelingstoewijzing Randomisatie wordt uitgevoerd in blokken van 10 met een toewijzingsratio van 1:1.

Bij inschrijving wordt de patiënt geïnterviewd en lichamelijk onderzocht en wordt een gestandaardiseerde vooraf gecodeerde vragenlijst ingevuld. Een veneus bloedmonster zal worden verzameld in steriele vacutainerbuizen die EDTA of zuur-citraat-dextrose (EDTA/ACD) bevatten van alle patiënten bij inschrijving. Bij volwassenen wordt minimaal 5 ml bloed - en maximaal 8 ml - afgenomen en bij kinderen wordt 1 ml/kg tot maximaal 5 ml afgenomen. Er worden twee bloeddruppels toegevoegd aan een buis van 1,5 ml met 500 µl RNAprotect-reagens (Qiagen).

3.5.3 Behandeling Alle patiënten krijgen een volledige behandeling van alleen AS (4 mg/kg/dag) of DHA-PPQ (streefdosis DHA=4 mg/kg/dag) gedurende 3 dagen om de vroege klaring van de parasiet te evalueren. Aangezien een 3-daagse AS-kuur onvoldoende is om P.falciparum te behandelen, zal deze volgens de aanbevelingen van de WHO worden aangevuld met een aanvullende 3-daagse DHA-PPQ-kuur. Patiënten zullen gedurende 60 minuten na de behandeling worden geobserveerd op bijwerkingen of braken. Die patiënten die hun medicatie binnen de eerste 30 minuten braken, krijgen een herhaalde volledige dosis; degenen die braken van 30-60 minuten krijgen een halve dosis.

Rescue-medicatie zal worden gegeven volgens de nationale richtlijnen:

Oraal reddingsmiddel: kinine (30 mg/kg/dag) en clindamycine (15 mg/kg/dag) gedurende 7 dagen; Rescue IV-medicijn: kinine (30 mg/kg/dag) en doxycycline (3 mg/kg/dag) gedurende 7 dagen 3.5.4. Follow-up vanaf dag 0 tot klaring van de parasiet: nadat de eerste dosis van het antimalariageneesmiddel is toegediend en gedurende 1 uur is geobserveerd, worden de patiënten elke 12 uur gecontroleerd door middel van bloedmicroscopie, ten minste tot dag 3 en indien nodig langer tot de klaring van de parasiet gedefinieerd is als twee opeenvolgende negatieve dia's. Bij elk bezoek wordt de patiënt geïnterviewd en fysiek onderzocht, wordt het follow-upformulier ingevuld en wordt elke bijwerking gedocumenteerd. Er wordt een bloedmonster via een vingerprik afgenomen voor de volgende resultaten: twee bloedglaasjes voor LM-observatie (dikke en dunne film), 200 µl bloed in een EDTA/ACD-microtainerbuis voor latere DNA-extractie en 2 druppels bloed in een andere microtainer buisje met RNAprotect voor latere RNA-extractie. Op dag 3 wordt een extra druppel bloed afgenomen om de Hb-concentratie te meten.

Dag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Patiënten zullen vervolgens worden gevraagd om de kliniek bij te wonen (of thuis te worden bezocht) voor elk vervolgbezoek, waarin ze worden geïnterviewd en onderzocht. worden ingevuld en eventuele ongewenste voorvallen worden gedocumenteerd. Er wordt een bloedmonster met een vingerprik afgenomen voor de volgende uitkomsten: twee bloedglaasjes voor LM-observatie (dikke en dunne film), 200μl bloed in een EDTA/ACD-microtainerbuisje voor DNA-extractie en 2 druppels bloed in een RNAprotect-bevattend microtainerbuisje . Op dag 7, 14, 28 en 42 wordt één druppel bloed afgenomen voor de Hb-concentratie (Hemocue).

Dag van recidief van P. falciparum Recidief wordt gedefinieerd als elke parasitemie van P. falciparum die wordt gedetecteerd door LM-onderzoek tijdens de follow-upperiode van de patiënt en na de initiële verwijdering van de parasiet. Als recidief wordt bevestigd, zal er nog een veneus bloedmonster worden afgenomen (minimaal 5 ml/maximaal 8 ml) voorafgaand aan de toediening van de noodbehandeling: ex-vivo assays zullen worden uitgevoerd met een deel van het bloed, terwijl de rest zal worden gecryopreserveerd voor toekomstig onderzoek naar geneesmiddelresistentie mechanismen.

3.5.5. Loss to follow-up & protocolschendingen Loss to follow-up treedt op wanneer, ondanks alle redelijke inspanningen, een geregistreerde patiënt de geplande bezoeken niet bijwoont en niet kan worden gevonden. Aan deze patiënten wordt geen behandelingsresultaat toegekend. Deze patiënten worden geclassificeerd als verloren voor follow-up en gecensureerd of uitgesloten van de analyse. Studiepatiënten die aan een van de volgende criteria voldoen, worden geclassificeerd als ingetrokken: i) intrekking van toestemming; ii) het niet voltooien van de behandeling; iii) inschrijvingsschending; iv) vrijwillige protocolschending; v) onvrijwillige schending van het protocol.

3.5.6 Laboratoriumprocedures en evaluatie Microscopie: bij de screening moeten drie objectglaasjes (dunne & dikke en dunne films) worden verkregen. Eén glaasje wordt snel gekleurd (10% Giemsa gedurende 15 minuten) voor de eerste screening. Zodra de patiënt is ingeschreven, zullen de andere twee objectglaasjes zorgvuldiger worden gekleurd (3% Giemsa gedurende 45 minuten). De parasietendichtheid wordt bepaald door het aantal aseksuele parasieten per 200 witte bloedcellen (WBC's) te tellen met een handteller. Als er meer dan 500 parasieten zijn geteld voordat 200 WBC's zijn bereikt, wordt de telling gestopt na voltooiing van het veld. Dichtheid, uitgedrukt als het aantal aseksuele parasieten per µl bloed, wordt berekend door het aantal aseksuele parasieten te delen door het aantal getelde WBC's en gecorrigeerd door de geschatte WBC-dichtheid (typisch 8000 per µl). Wanneer het aantal aseksuele parasieten in vervolguitstrijkjes minder is dan 10 per 200 witte bloedcellen, wordt er geteld tegen minimaal 500 witte bloedcellen. Een bloedplaatje wordt als negatief beschouwd wanneer onderzoek van 1000 witte bloedcellen geen aseksuele parasieten aan het licht brengt. De dichtheid van gametocyten wordt berekend door het aantal gametocyten per 500 WBC's te tellen.

De hemoglobineconcentratie (Hb) wordt gemeten op volbloed dat in een microcuvette is verzameld met behulp van Hemocue volgens de instructies van de fabrikant.

Moleculaire detectie van P. falciparum: DNA zal worden geëxtraheerd uit bloedmonsters die met een vingerprik zijn verzameld in microtainers. Moleculaire bevestiging van Plasmodium-soorten (P.vivax, P.falciparum, P.ovale en P.malariae) op dag 0 zal worden uitgevoerd door qPCR gericht op het 18S-ribosomale gen. Dezelfde qPCR-methode zal worden gebruikt om P. falciparum-infecties op dag 0 te identificeren en te kwantificeren en monsters op te volgen.

P. falciparum genotypering voor recrudescentie/nieuwe infectie: genotypering van de recidiverende infecties zal gebeuren door MSP1, MSP2 en GLURP, single-copy genen in het Plasmodium falciparum genoom te karakteriseren zoals elders beschreven.

RNA-extractie en RT-qPCR voor gametocyten: RNA zal worden geëxtraheerd uit RNAprotect-monsters met behulp van affiniteitskolommen en DNAse-digestie van genomisch DNA. Om P. falciparum-gametocytstadia te detecteren en te kwantificeren, zal een reverse transcriptie qPCR (RT-qPCR) gericht op Pfs25-gentranscripten worden uitgevoerd op dag 0 en in alle vervolgmonsters, volgens eerder beschreven protocollen met aanpassingen.

Ex vivo geneesmiddelgevoeligheidstesten: veneus bloed verzameld in EDTA/ACD-buisjes (op dag 0 en dag van recidief) wordt binnen 6 uur na afname verwerkt. Bloed wordt gecentrifugeerd en plasma en buffy coat worden verwijderd en bewaard bij -20ºC. Rode bloedcellen worden tweemaal gewassen in RPMI en opnieuw gesuspendeerd in kweekmedium (RPMI 1640 LPLF vloeibaar medium) tot een 50% hematocriet bloedmediummengsel (BMM).

Standaard ex vivo gevoeligheidstest voor geneesmiddelen: de beoordeling zal de WHO-richtlijnen volgen "Veldtoepassing van in vitro test voor de gevoeligheid van menselijke malariaparasieten voor antimalariamiddelen" voor de beoordeling van de respons van P. falciparum op artemisinines".

Ex vivo ring stage survival assays (RSA) Naast de standaard ex vivo assays zullen de prestaties van ring stage survival assays (RSA) worden onderzocht volgens een gepubliceerd protocol.

Moleculaire markers van artemisinineresistentie: geëxtraheerd DNA zal gebruikt worden om puntmutaties in het P. falciparum Kelch-propellerdomein (K13) te genotypen, die recent geïdentificeerd zijn als kandidaat-resistente moleculaire markers voor artemisinineresistentie. In het kort, K13 zal worden geamplificeerd in een geneste PCR met behulp van primers beschreven in WWARN-procedure INV11 [//www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Na bevestiging van agarosegelelektroforese worden de producten gesequenced en geanalyseerd om polymorfismen te identificeren. Er kunnen ook alternatieve opkomende kandidaten voor artemisinineresistentie worden onderzocht. 4. KWALITEITSBORGING Bezoeken ter plaatse zullen regelmatig worden gepland. Tijdens deze bezoeken zal de informatie die is vastgelegd op de case report-formulieren (CRF's) worden geverifieerd aan de hand van brondocumenten (bijv. laboratoriumgegevens en kliniekregisters). Nadat de CRF-formulieren aan het einde van de proefperiode zijn verzameld, worden ze beoordeeld op volledigheid en nauwkeurigheid. De gegevens worden ter plaatse dubbel ingevoerd in een elektronische database (Epi Info), waar speciaal ontworpen computercontroles worden gebruikt om verschillen in gegevensinvoer, ongeldige gegevensbereiken en algehele consistentie te identificeren. Alle discrepanties zullen worden opgelost door verwijzing naar de originele gecontroleerde gegevensverzamelingsformulieren.

Alle bloedfilmpjes bij opname worden zowel op de onderzoekslocatie als door een senior microscopist in een coördinerend centrum gelezen. Daarnaast zal er bij het ITG een externe kwaliteitscontrole gebeuren op 10% van de willekeurig geselecteerde dia's. Voor elk van de moleculaire testen (qPCR, RT-qPCR en genotypering van parasieten) zal 10% van de stalen die bij het NIMPE worden verwerkt willekeurig worden gekozen om opnieuw te worden geanalyseerd in het ITG. Externe kwaliteitscontrole van ex vivo drug assay resultaten zal gebeuren op het ITG waar de objectglaasjes opnieuw onderzocht zullen worden op 10% van de willekeurig gekozen isolaten.

5. Statistisch analyseplan De parasietenklaringstijd wordt gedefinieerd als de verstreken tijd (in uren) vanaf de behandelingstijd van de patiënt (eerste dosis) tot aan de eerste van twee opeenvolgende negatieve bloedglaasjes. Tijd en snelheid van het opruimen van parasieten, evenals de vertragingsfase, zullen worden aangepast met behulp van de online tool PCE die is ontwikkeld door de WWARN. De analyse van het genezingspercentage na 42 dagen zal worden uitgevoerd voor zowel de gemodificeerde intention-to-treat (mITT) patiëntenpopulatie (alle gerandomiseerde patiënten) als de evalueerbare patiëntenpopulatie (Per Protocol). Patiënten kunnen worden beoordeeld voor de analyse van het genezingspercentage na 28/42 dagen als het aantal parasieten wordt geregistreerd tot dag 26/40 of als de patiënt stopt vanwege "Onvoldoende therapeutisch effect" vanwege het opnieuw verschijnen van parasieten. De mITT-analyse omvat ook patiënten die vóór dag 28/42 stoppen om andere redenen dan "Onvoldoende therapeutisch effect" (dit kan bijvoorbeeld "bijwerking(en)" zijn vanwege herhaaldelijk braken). Deze patiënten zullen in de mITT-analyse worden meegeteld als mislukte behandeling, ongeacht de reden voor stopzetting. Patiënten die gelijktijdig werden behandeld met antibiotica die een antimalaria-effect hebben, worden uitgesloten van de evalueerbare patiënten en opgenomen in de mITT.

Voor categorische variabelen worden percentages en bijbehorende 95% betrouwbaarheidsintervallen berekend met behulp van de methode van Wilson. Verhoudingen worden vergeleken door de *2 te berekenen met de correctie van Yates of, indien van toepassing, met de exacte test van Fisher. Normaal verdeelde continue gegevens worden samengevat als gemiddelden en standaarddeviaties, en vergeleken met Student's t-test en variantieanalyse. Gegevens die niet conform een ​​normale verdeling zijn, worden samengevat als medianen (IQR) of geometrische gemiddelden en vergeleken met de Mann-Whitney U-test of Kruskal-Wallis-variantieanalyse. De associatie tussen 2 continue variabelen wordt beoordeeld met behulp van de rangcorrelatiecoëfficiënt van Spearman.

Het risico op falen van de behandeling op dag 28 en 42 zal allemaal worden geëvalueerd door middel van overlevingsanalyse met cumulatieve incidenties berekend met de Kaplan Meier-methode en vergeleken met de Mantel-Haenszel log-ranktest.

Parasiet-, koorts- en gametocytenklaringstijden zullen ook worden geëvalueerd volgens de Kaplan Meier-methode.

Hematologische veranderingen tijdens de eerste behandelingsweek en herstel tijdens wekelijkse follow-up zullen worden geëvalueerd door de veranderingen in Hb-concentratie tussen respectievelijk dag 0, 3, 7 en dag 14, 28 en 42 te meten.

6. ETHISCHE KWESTIES Ethische goedkeuringen Ethische toestemming om de studie uit te voeren zal verkregen zijn van de Ethische Commissie van het Nationaal Instituut voor Malariologie, Parasitologie en Entomologie, Hanoi en van de Universiteit Antwerpen, evenals van de Institutional Review Board van het ITG , Antwerpen.

Geïnformeerde toestemming Patiënten worden alleen in het onderzoek opgenomen als zij (of ouders of voogden van kinderen) geïnformeerde toestemming geven. Het toestemmingsverzoek is beschikbaar in het Engels en vertaald in het Vietnamees en wordt volledig voorgelezen aan de patiënt, ouder of voogd. Details over de proef en de voordelen en mogelijke risico's zullen worden uitgelegd. Na beantwoording van eventuele vragen wordt gevraagd om een ​​handtekening op het document. Als de patiënt analfabeet is, moet een geletterde getuige tekenen; indien mogelijk wordt de ondertekenaar geselecteerd door de deelnemer en heeft deze geen band met het onderzoeksteam.