P. 베트남에서 아르테미시닌에 대한 Falciparum 저항성

3.1 연구 설계 이 연구는 AS 또는 DHA-PPQ로 합병증이 없는 열대열열병 감염을 치료한 후 임상 및 기생충학적 반응을 평가하기 위한 무작위 공개 라벨 42일 후속 연구로 설계되었습니다. 연구 기준을 충족하는 P. falciparum 단일 감염이 있는 증상이 있는 환자가 연구에 등록되고 치료 부문 중 하나에 무작위 배정되어 42일 동안 추적 관찰됩니다. 모든 약물 투여를 직접 관찰하고 확장된 WHO 프로토콜에 따라 환자를 42일 동안 적극적으로 추적할 것입니다. 후속 조치가 끝나면 gametocytes를 보유한 모든 환자는 국가 지침에 따라 Primaquine(0.75mg/kg)의 단일 용량으로 치료됩니다.

3.2. 연구 장소 및 인구 연구는 P. falciparum 및 P.vivax 말라리아 발병률이 전국에서 가장 높은 Gia Lai 지방의 Krong Pa 지구에서 수행됩니다. 이 연구는 연구 팀이 말라리아 환자와 함께 지역 보건 직원 및 모든 주변 공동체 보건 센터와 함께 작업할 Chu R'Cam 코뮌에 위치할 것입니다.

지역 인구는 주로 산림 밭에서 화전 농업(주로 옥수수, 마니옥, 쌀), 고무 농장에서의 계절적 작업, 일상용품의 소규모 생산으로 구성되는 소수 민족인 Gia Rai로 구성되어 있습니다. 생계 또는 무역 e.g. 커피와 캐슈넛. 기후는 열대기후로 11월~4월은 건기, 5월~10월은 우기입니다. 이 지역은 언덕이 많고 숲이 우거져 있으며(2차 삼림) 주요 말라리아 매개체는 Anopheles dirus입니다.

3.4. 시험 모집단 대상 모집단에는 자발적으로 CHC에 나타나거나 주변 CHC의 보건 직원이 추천하는 P. falciparum 감염 환자가 모두 포함됩니다.

3.5. 재판 절차 3.5.1 선별. 검진 시 기본 등록 기준을 충족하는 모든 상담 환자에게는 연속 검진 번호가 부여되며 담당 의사가 심도 있게 평가합니다. 환자가 모든 등록 기준을 충족하면 환자(또는 어린이의 경우 부모나 보호자)에게 연구 참여에 대한 동의를 요청하고 연구 번호(ID=순차 번호 지정)를 할당합니다. 연구에 참여하지 않기로 결정한 사람은 보건부가 정한 치료 기준에 따라 보건 시설 직원이 검사, 치료 및 후속 조치를 취하게 됩니다.

3.5.2. 무작위화 및 치료 할당 무작위화는 할당 비율이 1:1인 10개의 블록에서 수행됩니다.

등록 시 환자는 면담을 하고 신체적 검사를 받으며 사전 코딩된 표준화된 설문지를 작성합니다. 등록 시 모든 환자의 정맥혈 샘플을 EDTA 또는 산-구연산-덱스트로스(EDTA/ACD)가 포함된 멸균 진공채혈관에 수집합니다. 성인의 경우 최소 5ml, 최대 8ml, 어린이의 경우 1ml/kg에서 최대 5ml의 혈액을 채취합니다. 500µL의 RNAprotect 시약(Qiagen)이 들어 있는 1.5ml 튜브에 혈액 두 방울을 넣습니다.

3.5.3 치료 모든 환자는 초기 기생충 제거를 평가하기 위해 3일 동안 AS 단독(4mg/kg/일) 또는 DHA-PPQ(목표 용량 DHA=4mg/kg/일)의 완전한 치료를 받게 됩니다. 3일 코스의 AS는 P.falciparum을 치료하기에 충분하지 않기 때문에 WHO 권장 사항에 따라 추가 3일 DHA-PPQ 요법으로 완료됩니다. 이상 반응이나 구토에 대해 치료 후 60분 동안 환자를 관찰할 것입니다. 처음 30분 이내에 약물을 토하는 환자는 전체 용량을 반복 투여받게 됩니다. 30-60분에 구토하는 사람은 절반 용량을 투여받게 됩니다.

구조 약물은 국가 지침에 따라 제공됩니다.

구조 경구 약물: 7일 동안 퀴닌(30mg/kg/일) 및 클린다마이신(15mg/kg/일); Rescue IV 약물: 7일 동안 퀴닌(30mg/kg/일) 및 독시사이클린(3mg/kg/일) 3.5.4. 0일부터 기생충 제거까지의 후속 조치: 항말라리아 약물의 첫 번째 용량을 투여하고 1시간 동안 관찰한 후 환자는 적어도 3일까지 혈액 현미경으로 12시간마다 모니터링되고 기생충 제거가 2로 정의될 때까지 필요에 따라 더 오래 모니터링됩니다. 연속 네거티브 슬라이드. 방문할 때마다 환자를 면담하고 신체 검사를 하고 후속 조치 양식을 작성하고 모든 부작용을 기록합니다. 다음 결과를 위해 손가락을 찔러 혈액 샘플을 수집합니다: LM 관찰을 위한 두 개의 혈액 슬라이드(두꺼운 필름 및 얇은 필름), 나중에 DNA 추출을 위해 EDTA/ACD 마이크로테이너 튜브에 혈액 200µl, 다른 마이크로테이너에 혈액 2방울 나중에 RNA 추출을 위해 RNAprotect가 들어있는 튜브. Hb 농도를 측정하기 위해 3일째에 혈액 한 방울을 추가로 채취합니다.

7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일 환자는 각 후속 방문에 대해 클리닉에 참석(또는 가정 방문)하도록 요청받게 되며, 그 동안 인터뷰 및 검사를 받게 됩니다. 완료하고 모든 부작용을 문서화합니다. 다음 결과를 위해 손가락을 찔러 혈액 샘플을 채취합니다: LM 관찰을 위한 2개의 혈액 슬라이드(두꺼운 필름 및 얇은 필름), DNA 추출을 위한 EDTA/ACD 마이크로테이너 튜브에 혈액 200μl, 마이크로테이너 튜브를 포함하는 RNAprotect에 혈액 2방울 . 7일, 14일, 28일 및 42일에 Hb 농도 측정을 위해 혈액 한 방울을 채취합니다(Hemocue).

P. falciparum 재발 일 재발은 환자의 추적 기간 동안 및 초기 기생충 제거 후 LM 검사에서 감지된 P. falciparum 기생충혈증으로 정의됩니다. 재발이 확인되면 구조 치료 투여 전에 추가 정맥혈 샘플을 수집합니다(최소 5ml/최대 8ml): 혈액의 한 부분으로 체외 분석을 수행하고 나머지는 약물 내성에 대한 향후 조사를 위해 냉동 보존합니다. 메커니즘.

3.5.5. 후속 조치 실패 및 프로토콜 위반 모든 합당한 노력에도 불구하고 등록된 환자가 예정된 방문에 참석하지 않고 찾을 수 없는 경우 후속 조치 실패가 발생합니다. 이 환자들에게는 치료 결과가 지정되지 않습니다. 이러한 환자는 후속 조치에 실패한 것으로 분류되고 분석에서 제외되거나 중도절단됩니다. 다음 기준 중 하나를 충족하는 연구 환자는 철회된 것으로 분류됩니다: i) 동의 철회; ii) 치료를 완료하지 못함; iii) 등록 위반; iv) 자발적인 프로토콜 위반; v) 비자발적 프로토콜 위반.

3.5.6 실험실 절차 및 평가 현미경 검사: 스크리닝 시 3개의 슬라이드(얇은 필름, 두꺼운 필름 및 얇은 필름)를 얻어야 합니다. 하나의 슬라이드는 초기 스크리닝을 위해 빠르게 염색됩니다(15분 동안 10% Giemsa). 환자가 등록되면 다른 두 슬라이드는 더 조심스럽게 염색됩니다(45분 동안 3% Giemsa). 기생충 밀도는 손 집계 계수기로 200개의 백혈구(WBC)당 무성 기생충의 수를 세어 결정됩니다. 200 WBC에 도달하기 전에 500개 이상의 기생충이 계수된 경우 필드 완료 후 계수가 중지됩니다. 밀도는 혈액 μl당 무성 기생충의 수로 표현되며 무성 기생충의 수를 계산된 WBC의 수로 나누어 계산하고 추정된 WBC 밀도(일반적으로 μl당 8000)로 수정합니다. 후속 도말 검사에서 무성 기생충의 수가 백혈구 200개당 10개 미만인 경우 최소 500개 백혈구에 대해 계수합니다. 1000개의 백혈구 검사에서 무성 기생충이 발견되지 않으면 혈액 슬라이드는 음성으로 간주됩니다. Gametocyte 밀도는 WBC 500개당 gametocytes의 수를 세어 계산합니다.

헤모글로빈(Hb) 농도는 제조업체 지침에 따라 Hemocue를 사용하여 마이크로 큐벳에 수집된 전혈에서 측정됩니다.

P. falciparum 분자 검출: 마이크로테이너에서 채취한 손가락으로 채혈한 혈액 샘플에서 DNA를 추출합니다. 0일에 Plasmodium 종(P.vivax, P.falciparum, P.ovale 및 P.malariae)의 분자 확인은 18S 리보솜 유전자를 표적으로 하는 qPCR에 의해 수행될 것입니다. 동일한 qPCR 방법을 사용하여 Day 0 및 후속 샘플에서 P. falciparum 감염을 식별하고 정량화합니다.

재발성/신규 감염에 대한 P. falciparum 유전형 분석: 재발성 감염의 유전형 분석은 다른 곳에서 설명한 바와 같이 Plasmodium falciparum 게놈의 단일 복제 유전자인 MSP1, MSP2 및 GLURP를 특성화하여 수행됩니다.

gametocytes에 대한 RNA 추출 및 RT-qPCR: 친화도 컬럼과 게놈 DNA의 DNAse 소화를 사용하여 RNAprotect 샘플에서 RNA를 추출합니다. P. falciparum gametocyte 단계를 검출하고 정량화하기 위해 Pfs25 유전자 전사체를 표적으로 하는 역전사 qPCR(RT-qPCR)은 수정된 이전에 설명한 프로토콜에 따라 Day 0 및 모든 후속 샘플에서 수행됩니다.

생체외 약물 감수성 분석: EDTA/ACD 튜브에 수집된 정맥혈(0일 및 재발일)은 수집 후 6시간 이내에 처리됩니다. 혈액을 원심분리하고 혈장과 연막을 제거하여 -20ºC에서 보관합니다. 적혈구는 RPMI에서 두 번 세척되고 배양 배지(RPMI 1640 LPLF 액체 배지)에서 50% 헤마토크리트 혈액 배지 혼합물(BMM)로 재현탁됩니다.

표준 생체외 약물 감수성 분석: 평가는 아르테미시닌에 대한 P. falciparum의 반응 평가를 위한 WHO 지침 "말라리아 기생충에 대한 인간 말라리아 기생충의 민감성에 대한 시험관 내 분석의 현장 적용"을 따를 것입니다.

생체외 환기 생존 분석(RSA) 표준 생체외 분석에 더하여, 환기 생존 분석(RSA)의 성능은 발표된 프로토콜에 따라 탐구될 것입니다.

아르테미시닌 내성의 분자 마커: 추출된 DNA는 최근 아르테미시닌 내성에 대한 후보 내성 분자 마커로 확인된 P. falciparum Kelch 프로펠러 도메인(K13)의 점 돌연변이를 유전형화하는 데 사용될 것입니다. 간단히 말해서 K13은 WWARN 절차 INV11[http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]에 설명된 프라이머를 사용하여 중첩된 PCR에서 증폭됩니다. 아가로스 겔 전기영동 확인 후, 제품은 다형성을 식별하기 위해 시퀀싱 및 분석됩니다. 아르테미시닌 내성에 대한 대안 후보 후보도 탐색할 수 있습니다. 4. 품질 보증 현장 모니터링 방문은 정기적으로 예정됩니다. 이러한 방문 중에 증례 보고서 양식(CRF)에 기록된 정보는 원본 문서(예: 실험실 기록 및 진료소 등록부)와 비교하여 확인됩니다. 시험이 끝날 때 CRF 양식이 수집된 후 완전성과 정확성을 위해 검토됩니다. 데이터는 사이트에서 전자 데이터베이스(Epi Info)에 이중으로 입력되며, 여기에서 데이터 입력 불일치, 유효하지 않은 데이터 범위 및 전반적인 일관성을 식별하기 위해 특별히 고안된 컴퓨터 검사가 사용됩니다. 모든 불일치는 확인된 원본 데이터 수집 양식을 참조하여 해결됩니다.

입학 시 모든 혈액 필름은 조정 센터의 선임 현미경 검사관뿐만 아니라 연구 현장에서도 판독됩니다. 또한 무작위로 선택한 슬라이드의 10%에 대해 ITM에서 외부 품질 관리를 수행합니다. 각 분자 분석(qPCR, RT-qPCR 및 기생충 유전자형 분석)에 대해 NIMPE에서 처리된 샘플의 10%가 무작위로 선택되어 ITM에서 재분석됩니다. 생체 외 약물 분석 결과의 외부 품질 관리는 슬라이드가 무작위로 선택된 분리물의 10%에 대해 재검사되는 ITM에서 수행됩니다.

5. 통계 분석 계획 기생충 제거 시간은 환자의 치료(첫 번째 투여) 시간부터 두 개의 연속적인 음성 혈액 슬라이드 중 첫 번째까지의 경과 시간(시간)으로 정의됩니다. 기생충 제거 시간 및 속도와 지체 단계는 WWARN에서 개발한 PCE 온라인 도구를 사용하여 맞춰집니다. 42일 치료율의 분석은 수정된 치료 의도(mITT) 환자 모집단(모든 무작위 환자) 및 평가 가능한 환자 모집단(프로토콜당) 모두에 대해 수행됩니다. 26/40일까지 기생충 수가 기록되거나 기생충의 재발로 인한 "불만족스러운 치료 효과"로 인해 환자가 중단하는 경우 환자는 28/42일 치료율 분석을 위해 평가할 수 있습니다. mITT 분석에는 "불만족스러운 치료 효과" 이외의 이유로 인해 28/42일 이전에 중단한 환자도 포함됩니다(예: 여기에는 반복되는 구토로 인한 "이상한 경험"이 포함될 수 있음). 이러한 환자는 중단 이유에 관계없이 mITT 분석에서 치료 실패로 간주됩니다. 항말라리아 효과가 있는 항생제로 병용 치료를 받은 환자는 평가 가능한 환자에서 제외되고 mITT에 포함됩니다.

범주형 변수의 경우 백분율 및 해당 95% 신뢰 구간은 윌슨의 방법을 사용하여 계산됩니다. 비율은 Yates의 수정으로 *2를 계산하거나 적절한 경우 Fisher의 정확한 테스트를 통해 비교됩니다. 정규분포된 연속 데이터를 평균과 표준편차로 요약하고 Student's t test와 분산분석으로 비교한다. 정규 분포를 따르지 않는 데이터는 중앙값(IQR) 또는 기하 평균으로 요약되고 Mann-Whitney U 테스트 또는 Kruskal-Wallis 분산 분석으로 비교됩니다. 2개의 연속 변수 간의 연관성은 Spearman의 순위 상관 계수를 사용하여 평가됩니다.

28일 및 42일까지의 치료 실패 위험은 모두 Kaplan Meier 방법으로 계산된 누적 발생률과 함께 생존 분석에 의해 평가되고 Mantel-Haenszel 로그 순위 테스트로 비교됩니다.

기생충, 열 및 gametocyte 클리어런스 시간도 Kaplan Meier 방법으로 평가합니다.

0일, 3일, 7일, 14일, 28일, 42일 사이에 각각 Hb 농도의 변화를 측정하여 치료 첫 주 동안의 혈액학적 변화와 매주 추적 관찰 중 회복을 평가할 것입니다.

6. 윤리적 문제 윤리적 허가 연구를 수행하기 위한 윤리적 허가는 국립 말라리아학, 기생충학 및 곤충학 연구소(하노이)와 앤트워프 대학의 윤리 위원회와 ITM의 기관 검토 위원회로부터 얻어질 것입니다. , 앤트워프.

정보에 입각한 동의 환자(또는 아동의 부모 또는 보호자)가 정보에 입각한 동의를 한 경우에만 환자가 연구에 포함됩니다. 동의 요청은 영어로 제공되며 베트남어로 번역되어 환자, 부모 또는 보호자에게 완전히 읽혀집니다. 시험과 그 이점 및 잠재적 위험에 대한 세부 사항이 설명됩니다. 질문에 대한 답변이 완료되면 문서에 서명이 요청됩니다. 환자가 글을 읽을 수 없는 경우 글을 읽을 수 있는 증인이 서명해야 합니다. 가능한 경우 서명인은 참가자가 선택하며 연구팀과 연결되지 않습니다.