P. Falciparum Motstånd mot Artemisinin i Vietnam

3.1 Studiedesign Denna studie är utformad som en randomiserad öppen 42-dagars uppföljningsstudie för att utvärdera de kliniska och parasitologiska svaren efter behandling av okomplicerade P.falciparum-infektioner med antingen AS eller DHA-PPQ. Symtomatiska patienter med P.falciparum-monoinfektioner som uppfyller studiekriterierna kommer att inkluderas i studien, randomiseras till en av behandlingsarmarna och följas upp i 42 dagar. All läkemedelsadministrering kommer att observeras direkt och patienterna kommer att följas aktivt upp i 42 dagar enligt ett utökat WHO-protokoll. Vid slutet av uppföljningstiden kommer alla patienter som bär gametocyter att behandlas med en engångsdos av Primaquine (0,75 mg/kg) enligt nationella riktlinjer.

3.2. Studieplats och population Studien kommer att genomföras i Krong Pa-distriktet, Gia Lai-provinsen där både P.falciparum och P.vivax malariaincidensen är den högsta i landet. Studien kommer att placeras i Chu R'Cam kommun där studieteamet kommer att arbeta tillsammans med den lokala hälsopersonalen och alla omgivande kommuners vårdcentraler med malariapatienter.

Lokalbefolkningen består huvudsakligen av den etniska minoriteten Gia Rai vars huvudsakliga sysselsättning består av slash and burn jordbruk (främst majs, maniok och ris) i skogsfält, tillsammans med säsongsarbete i gummiplantager och småskalig produktion av varor för dagligt bruk uppehälle eller handel t.ex. kaffe och cashewnötter. Klimatet är tropiskt med en torrperiod från november till april och regnperioden från maj till oktober. Området är kuperat och skogbevuxet (sekundärskog) och den huvudsakliga malariavektorn är Anopheles dirus.

3.4. Försökspopulation Målpopulationen inkluderar alla P. falciparum-infekterade patienter som antingen presenterar sig spontant till CHC eller remitteras av hälsopersonalen på de omgivande CHC:erna.

3.5. Försöksprocedurer 3.5.1 Screening. Alla konsulterande patienter som uppfyller de grundläggande registreringskriterierna under screening kommer att tilldelas ett kontinuerligt screeningnummer och utvärderas mer ingående av läkaren. När patienten uppfyller alla registreringskriterier kommer han eller hon (eller en förälder eller vårdnadshavare i fråga om barn) att tillfrågas om samtycke för att delta i studien och kommer att tilldelas ett studienummer (ID=sekventiell numrering). Varje person som beslutar sig för att inte delta i studien kommer att undersökas, behandlas och följas upp av vårdinrättningens personal enligt den vårdstandard som fastställts av hälsoministeriet.

3.5.2. Randomisering och behandlingsallokering Randomisering kommer att utföras i block om 10 med ett tilldelningsförhållande på 1:1.

Vid inskrivningen kommer patienten att intervjuas och undersökas fysiskt och ett standardiserat förkodat frågeformulär kommer att fyllas i. Ett venöst blodprov kommer att samlas in i sterila vacutainerrör som innehåller EDTA eller syra-citrat-dextros (EDTA/ACD) från alla patienter vid inskrivningen. Minst 5 ml blod - och högst 8 ml - kommer att samlas in från vuxna, och 1 ml/kg upp till 5 ml kommer att samlas in från barn. Två bloddroppar tillsätts i ett 1,5 ml rör som innehåller 500 µL RNAprotect-reagens (Qiagen).

3.5.3 Behandling Alla patienter kommer att få en fullständig behandling av antingen AS enbart (4mg/kg/dag) eller DHA-PPQ (måldos DHA=4mg/kg/dag) i 3 dagar för att utvärdera tidig parasitrensning. Eftersom en 3-dagars kur med AS är otillräcklig för att behandla P.falciparum, kommer den att kompletteras med en ytterligare 3-dagars DHA-PPQ-kur enligt WHO:s rekommendationer. Patienter kommer att observeras i 60 minuter efter behandling för biverkningar eller kräkningar. De patienter som kräks sin medicin inom de första 30 minuterna kommer att få en upprepad full dos; de som kräks från 30-60 minuter kommer att få halv dos.

Räddningsmediciner kommer att ges enligt nationella riktlinjer:

Rescue oral drog: kinin (30 mg/kg/dag) och clindamycin (15 mg/kg/dag) i 7 dagar; Rescue IV-läkemedel: Kinin (30 mg/kg/dag) och doxycyklin (3 mg/kg/dag) i 7 dagar 3.5.4. Uppföljning från dag 0 till parasitclearance: efter att den första dosen av antimalarialäkemedel har administrerats och observerats under en timme, kommer patienter att övervakas var 12:e timme med blodmikroskopi åtminstone fram till dag 3 och längre om nödvändigt tills parasitclearance definieras som två negativa bilder i följd. Vid varje besök kommer patienten att intervjuas och undersökas fysiskt, uppföljningsformuläret fylls i och eventuella biverkningar dokumenteras. Ett blodprov med fingerstick kommer att samlas in för följande resultat: två blodglas för LM-observation (tjock och tunn film), 200 µl blod i ett EDTA/ACD-mikrotainerrör för senare DNA-extraktion och 2 droppar blod i en annan mikrobehållare rör som innehåller RNAprotect för senare RNA-extraktion. En ytterligare droppe blod kommer att tas på dag 3 för att mäta Hb-koncentrationen.

Dag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Patienterna kommer sedan att uppmanas att besöka kliniken (eller besökas hemma) för varje uppföljningsbesök, under vilket de kommer att intervjuas och undersökas, uppföljningsformuläret kommer att slutföras och eventuella biverkningar dokumenteras. Ett fingersticksblodprov kommer att samlas in för följande resultat: två blodglas för LM-observation (tjock och tunn film), 200 μl blod i ett EDTA/ACD-mikrotainerrör för DNA-extraktion och 2 droppar blod i RNAprotect-innehållande mikrotainerrör . På dag 7, 14, 28 och 42 tas en droppe blod för Hb-koncentration (Hemocue).

Dag för P. falciparum-recidiv Återfall definieras som eventuell P.falciparum-parasitaemi som upptäcks genom LM-undersökning under patientens uppföljningsperiod och efter initial parasitrensning. Om återfall bekräftas kommer ytterligare ett venöst blodprov att samlas in (minst 5 ml/högst 8 ml) före administrering av räddningsbehandling: ex-vivo-analyser kommer att göras med en del av blodet medan återstående kommer att kryokonserveras för framtida undersökningar av läkemedelsresistens mekanismer.

3.5.5. Förlust till uppföljning & protokollbrott Förlust till uppföljning uppstår när, trots alla rimliga ansträngningar, en inskriven patient inte närvarar vid de schemalagda besöken och inte kan hittas. Inget behandlingsresultat kommer att tilldelas dessa patienter. Dessa patienter kommer att klassificeras som förlorade för uppföljning och censureras eller exkluderas från analysen. Studiepatienter som uppfyller något av följande kriterier kommer att klassificeras som återkallade: i) återkallande av samtycke; ii) misslyckande med att fullfölja behandlingen; iii) registreringsöverträdelse; iv) frivilligt protokollöverträdelse; v) ofrivilligt brott mot protokollet.

3.5.6 Laboratorieprocedurer och utvärdering Mikroskopi: tre objektglas (tunna & tjocka och tunna filmer) ska erhållas vid screening. Ett objektglas färgas snabbt (10 % Giemsa i 15 min) för initial screening. När patienten väl har registrerats kommer de andra två objektglasen att färgas noggrannare (3 % Giemsa i 45 min). Parasitdensitet kommer att bestämmas genom att räkna antalet asexuella parasiter per 200 vita blodkroppar (WBC) med en handräkningsräknare. Om mer än 500 parasiter har räknats innan de når 200 WBC, kommer räkningen att stoppas efter att fältet är klart. Densitet, kommer att uttryckas som antalet asexuella parasiter per µl blod, kommer att beräknas genom att dividera antalet asexuella parasiter med antalet WBC som räknas och korrigeras med den uppskattade WBC-densiteten (vanligtvis 8000 per µl). När antalet asexuella parasiter är mindre än 10 per 200 vita blodkroppar vid uppföljande utstryk, kommer räkning att göras mot minst 500 vita blodkroppar. Ett blodglidning kommer att betraktas som negativt när undersökning av 1000 vita blodkroppar avslöjar inga asexuella parasiter. Gametocyttäthet kommer att beräknas genom att räkna antalet gametocyter per 500 WBC.

Hemoglobinkoncentrationen (Hb) kommer att mätas på helblod som samlats in i mikrokyvett med Hemocue enligt tillverkarens instruktioner.

P. falciparum molekylär detektion: DNA kommer att extraheras från blodprover med fingerstick som samlats in i mikrobehållare. Molekylär bekräftelse av Plasmodium-arter (P.vivax, P.falciparum, P.ovale och P.malariae) på dag 0 kommer att utföras med qPCR riktad mot 18S ribosomal gen. Samma qPCR-metod kommer att användas för att identifiera och kvantifiera P. falciparum-infektioner på dag 0 och följa upp prover.

P. falciparum-genotypning för återväxt/ny infektion: genotypning av de återkommande infektionerna kommer att göras genom att karakterisera MSP1, MSP2 och GLURP, enkelkopiagener i Plasmodium falciparum-genomet som beskrivs på annat håll.

RNA-extraktion och RT-qPCR för gametocyter: RNA kommer att extraheras från RNAprotect-prover med användning av affinitetskolonner och DNAs-digestion av genomiskt DNA. För att detektera och kvantifiera P. falciparum gametocytstadier kommer en omvänd transkription qPCR (RT-qPCR) riktad mot Pfs25-gentranskript att göras på dag 0 och i alla uppföljningsprover, enligt tidigare beskrivna protokoll med modifieringar.

Ex vivo läkemedelskänslighetsanalyser: venöst blod som samlats in i EDTA/ACD-rör (på dag 0 och dag för återfall) kommer att behandlas inom 6 timmar efter insamling. Blod kommer att centrifugeras och plasma och buffy coat tas bort och förvaras vid -20ºC. Röda blodkroppar kommer att tvättas två gånger i RPMI och återsuspenderas i odlingsmedium (RPMI 1640 LPLF flytande medium) till en 50 % hematokritblodmediumblandning (BMM).

Standard ex vivo-läkemedelskänslighetsanalys: bedömningen kommer att följa WHO:s riktlinjer "Fälttillämpning av in vitro-analys för känsligheten av humana malariaparasiter mot malarialäkemedel" för bedömning av svaret från P. falciparum på artemisininer".

Ex vivo ring stage survival assays (RSA) Förutom standard ex vivo analyser kommer prestandan för ring stage survival assays (RSA) att undersökas enligt ett publicerat protokoll.

Molekylära markörer för artemisininresistens: extraherat DNA kommer att användas för att genotypa punktmutationer i P. falciparum Kelch propellerdomän (K13), som nyligen har identifierats som kandidatresistens molekylära markörer för artemisininresistens. Kortfattat kommer K13 att amplifieras i en kapslad PCR med användning av primrar som beskrivs i WWARN-förfarande INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Efter bekräftelse av agarosgelelektrofores kommer produkterna att sekvenseras och analyseras för att identifiera polymorfismer. Alternativa kommande kandidater för artemisininresistens kan också utforskas. 4. KVALITETSSÄKRING Besök på platsövervakning kommer att planeras regelbundet. Under dessa besök kommer information som registreras på fallrapportformulären (CRF) att verifieras mot källdokument (t.ex. laboratoriejournaler och klinikregister). Efter att CRF-formulären har samlats i slutet av försöket kommer de att granskas för fullständighet och korrekthet. Uppgifterna kommer att dubbelinföras på plats i en elektronisk databas (Epi Info), där specialdesignade datorkontroller används för att identifiera avvikelser i datainmatningen, ogiltiga dataintervall och övergripande konsistens. Alla avvikelser kommer att lösas med hänvisning till de ursprungliga kontrollerade datainsamlingsformulären.

Alla blodfilmer vid antagning kommer att läsas på studieplatsen samt av en senior mikroskopist vid ett koordinerande centrum. Dessutom kommer en extern kvalitetskontroll att göras på ITM på 10 % av slumpmässigt utvalda bilder. För var och en av de molekylära analyserna (qPCR, RT-qPCR och parasitgenotypning) kommer 10 % av proverna som bearbetas vid NIMPE att väljas slumpmässigt för att analyseras på nytt vid ITM. Extern kvalitetskontroll av ex vivo läkemedelsanalysresultat kommer att göras vid ITM där objektglasen kommer att undersökas på nytt för 10 % av de slumpmässigt valda isolaten.

5. Plan för statistisk analys Parasitens elimineringstid definieras som den tid som förflutit (i timmar) från patientens behandlingstid (första dosen) till den första av två på varandra följande negativa blodglas. Parasitrensningstid och -hastighet samt lagfas kommer att anpassas med PCE-onlineverktyget utvecklat av WWARN. Analysen av 42 dagars botningsfrekvens kommer att utföras både för den modifierade intention-to-treat (mITT) patientpopulationen (alla randomiserade patienter) och den utvärderbara patientpopulationen (Per Protocol). Patienter kan utvärderas för analys av 28/42 dagars botningsfrekvens om antalet parasiter registreras upp till dag 26/40 eller om patienten avbryter behandlingen på grund av "otillfredsställande terapeutisk effekt" på grund av att parasiter återkommer. mITT-analysen inkluderar också patienter som avbryter behandlingen före dag 28/42 på grund av andra orsaker än "otillfredsställande terapeutisk effekt" (t.ex. kan detta inkludera "biverkning(er)" på grund av upprepade kräkningar). Dessa patienter kommer att räknas i mITT-analysen som behandlingsmisslyckanden oavsett orsaken till att behandlingen avbröts. Patienter som hade samtidig behandling med antibiotika som har en anti-malaria effekt kommer att exkluderas från de utvärderbara patienterna och inkluderas i mITT.

För kategoriska variabler kommer procentsatser och motsvarande 95 % konfidensintervall att beräknas med Wilsons metod. Proportioner kommer att jämföras genom att beräkna *2 med Yates korrigering eller genom Fishers exakta test där så är lämpligt. Normalfördelade kontinuerliga data kommer att sammanfattas som medelvärden och standardavvikelser, och jämföras med Students t-test och variansanalys. Data som inte överensstämmer med en normalfördelning kommer att sammanfattas som medianer (IQR) eller geometriska medelvärden och jämföras med Mann-Whitney U-testet eller Kruskal-Wallis variansanalys. Sambandet mellan 2 kontinuerliga variabler kommer att bedömas med Spearmans rangkorrelationskoefficient.

Risken för behandlingsmisslyckande dag 28 och 42 kommer alla att utvärderas genom överlevnadsanalys med kumulativa incidenser beräknade med Kaplan Meier-metoden och jämförda med Mantel-Haenszel log rank test.

Parasit-, feber- och gametocytclearancetider kommer också att utvärderas med Kaplan Meier-metoden.

Hematologiska förändringar under den första behandlingsveckan samt återhämtning under veckouppföljning kommer att utvärderas genom att mäta förändringarna i Hb-koncentrationen mellan dag 0, 3, 7 respektive dag 14, 28 och 42.

6. ETISKA FRÅGOR Etiskt tillstånd Etiskt tillstånd för att genomföra studien kommer att ha erhållits från den etiska kommittén vid National Institute of Malariology, Parasitology and Entomology, Hanoi och vid universitetet i Antwerpen, samt från den institutionella granskningsnämnden vid ITM , Antwerpen.

Informerat samtycke Patienter kommer endast att inkluderas i studien om de (eller föräldrar eller vårdnadshavare till barn) ger informerat samtycke. Begäran om samtycke är tillgänglig på engelska och översatt till vietnamesiska språket kommer att läsas helt för patienten, föräldern eller vårdnadshavaren. Detaljer om prövningen och dess fördelar och potentiella risker kommer att förklaras. När eventuella frågor har besvarats kommer en underskrift att begäras på dokumentet. Om patienten är analfabet måste ett läskunnigt vittne skriva under; om möjligt kommer undertecknaren att väljas av deltagaren och kommer inte att ha någon koppling till forskargruppen.