P. Falciparum Устойчивость к артемизинину во Вьетнаме

3.1 Дизайн исследования Это исследование разработано как рандомизированное открытое 42-дневное последующее исследование для оценки клинического и паразитологического ответа после лечения неосложненных инфекций, вызванных P.falciparum, с помощью АС или DHA-PPQ. Симптоматические пациенты с моноинфекцией P.falciparum, отвечающие критериям исследования, будут включены в исследование, рандомизированы в одну из групп лечения и будут наблюдаться в течение 42 дней. Все вводимые препараты будут находиться под непосредственным наблюдением, а пациенты будут находиться под активным наблюдением в течение 42 дней в соответствии с расширенным протоколом ВОЗ. В конце периода наблюдения всем пациентам с гаметоцитами будет назначена однократная доза примахина (0,75 мг/кг) в соответствии с национальными рекомендациями.

3.2. Место проведения исследования и население Исследование будет проводиться в округе Кронг Па, провинция Зя Лай, где заболеваемость малярией P.falciparum и P.vivax является самой высокой в ​​стране. Исследование будет проходить в коммуне Чу Р'Кам, где исследовательская группа будет работать вместе с местным медицинским персоналом и центрами здоровья всех близлежащих коммун с больными малярией.

Местное население в основном состоит из этнического меньшинства Гиа Рай, основные занятия которого состоят из подсечно-огневого земледелия (в основном кукурузы, маниока и риса) в лесных полях, а также сезонных работ на каучуковых плантациях и мелкосерийного производства товаров для повседневного потребления. пропитание или торговля кофе и орехи кешью. Климат тропический с сухим сезоном с ноября по апрель и сезоном дождей с мая по октябрь. Район холмистый и засажен деревьями (вторичный лес), а основным переносчиком малярии является Anopheles dirus.

3.4. Испытуемая популяция Целевая популяция включает всех пациентов, инфицированных P. falciparum, либо спонтанно обратившихся в ЦПМ, либо направленных медицинским персоналом близлежащих ЦПМ.

3.5. Судебные процедуры 3.5.1 Скрининг. Всем консультирующимся пациентам, которые соответствуют основным критериям регистрации во время скрининга, будет присвоен последовательный скрининговый номер, и врач будет более тщательно их оценивать. Как только пациент соответствует всем критериям включения, его или ее (или родителя или опекуна в случае детей) попросят дать согласие на участие в исследовании, и ему будет присвоен номер исследования (ID = порядковая нумерация). Любой человек, решивший не участвовать в исследовании, будет обследован, пролечен и под наблюдением персонала медицинского учреждения в соответствии со стандартом медицинской помощи, установленным Министерством здравоохранения.

3.5.2. Рандомизация и распределение лечения Рандомизация будет проводиться блоками по 10 с соотношением распределения 1:1.

При регистрации пациент будет опрошен и осмотрен физически, после чего будет заполнена стандартизированная предварительно закодированная анкета. Образец венозной крови будет собираться в стерильные пробирки для вакутейнеров, содержащие ЭДТА или кислотно-цитратно-декстрозный (ЭДТА/АКД) у всех пациентов при включении в исследование. У взрослых будет взято не менее 5 мл крови и не более 8 мл, а у детей — от 1 мл/кг до 5 мл. Две капли крови будут добавлены в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл реагента RNAprotect (Qiagen).

3.5.3 Лечение Все пациенты будут получать полный курс лечения либо только АС (4 мг/кг/день), либо ДГК-ППФ (целевая доза ДГК = 4 мг/кг/день) в течение 3 дней для оценки ранней элиминации паразитов. Поскольку 3-дневного курса АС недостаточно для лечения P.falciparum, в соответствии с рекомендациями ВОЗ он будет дополнен дополнительным 3-дневным курсом ДГК-ППФ. Пациенты будут наблюдаться в течение 60 минут после лечения на предмет побочных реакций или рвоты. Те пациенты, которые рвут свое лекарство в течение первых 30 минут, получат повторную полную дозу; те, кого рвет от 30 до 60 минут, получат половину дозы.

Спасательные лекарства будут предоставлены в соответствии с национальными рекомендациями:

Спасательный пероральный препарат: хинин (30 мг/кг/день) и клиндамицин (15 мг/кг/день) в течение 7 дней; Спасательный препарат для внутривенного введения: хинин (30 мг/кг/день) и доксициклин (3 мг/кг/день) в течение 7 дней 3.5.4. Последующее наблюдение С 0-го дня до элиминации паразитов: после введения первой дозы противомалярийного препарата и наблюдения в течение одного часа пациенты будут контролироваться каждые 12 часов с помощью микроскопии крови, по крайней мере, до 3-го дня и дольше, если необходимо, до элиминации паразитов, определяемой как два последовательные отрицательные слайды. При каждом посещении пациент будет опрошен и осмотрен физически, заполнена форма последующего наблюдения и документированы любые нежелательные явления. Образец крови из пальца будет взят для следующих результатов: два предметных стекла крови для наблюдения ЛМ (толстая и тонкая пленка), 200 мкл крови в пробирку микротейнера с ЭДТА/АКД для последующего извлечения ДНК и 2 капли крови в другой микротейнер. пробирку, содержащую RNAprotect, для последующего выделения РНК. На 3-й день будет взята дополнительная капля крови для измерения концентрации гемоглобина.

День 7, 14, 21, 28, 35, 42 Пациентов затем попросят посетить клинику (или посетить их дома) для каждого последующего визита, во время которого они будут опрошены и осмотрены, форма последующего наблюдения будет должны быть завершены, а любые неблагоприятные события задокументированы. Образец крови из пальца будет собран для следующих результатов: два предметных стекла крови для наблюдения ЛМ (толстая и тонкая пленка), 200 мкл крови в пробирке с микротейнерами с ЭДТА/АКД для выделения ДНК и 2 капли крови в пробирке с РНКзащитой. . В дни 7, 14, 28 и 42 будет взята одна капля крови для определения концентрации гемоглобина (Hemocue).

День рецидива P. falciparum Рецидив определяется как любая паразитемия, вызванная P.falciparum, обнаруженная при обследовании ЛМ в течение периода наблюдения пациента и после исходной элиминации паразитов. Если рецидив подтвердится, будет взят дополнительный образец венозной крови (минимум 5 мл/максимум 8 мл) перед назначением спасательного лечения: анализы ex vivo будут проводиться с одной частью крови, а оставшаяся часть будет криоконсервирована для будущих исследований лекарственной устойчивости. механизмы.

3.5.5. Потеря для последующего наблюдения и нарушения протокола Потеря для последующего наблюдения происходит, когда, несмотря на все разумные усилия, зарегистрированный пациент не посещает запланированные визиты и не может быть найден. Этим пациентам не будет назначен результат лечения. Эти пациенты будут классифицированы как потерянные для последующего наблюдения и подвергнуты цензуре или исключены из анализа. Пациенты исследования, которые соответствуют любому из следующих критериев, будут классифицированы как выбывшие: i) отзыв согласия; ii) неспособность завершить лечение; iii) нарушение зачисления; iv) добровольное нарушение протокола; v) невольное нарушение протокола.

3.5.6 Лабораторные процедуры и оценка. Микроскопия: при скрининге необходимо получить три предметных стекла (тонкие и толстые и тонкие пленки). Один слайд будет быстро окрашен (10% Гимза в течение 15 минут) для первоначального скрининга. После регистрации пациента два других предметных стекла будут окрашены более тщательно (3% Гимза в течение 45 минут). Плотность паразитов будет определяться путем подсчета количества бесполых паразитов на 200 лейкоцитов (лейкоцитов) с помощью ручного счетчика. Если до достижения 200 лейкоцитов было подсчитано более 500 паразитов, после заполнения поля подсчет будет остановлен. Плотность, выражаемая как количество бесполых паразитов на мкл крови, будет рассчитываться путем деления количества бесполых паразитов на количество подсчитанных лейкоцитов и с поправкой на расчетную плотность лейкоцитов (обычно 8000 на мкл). При количестве бесполых паразитов менее 10 на 200 лейкоцитов в контрольных мазках подсчет проводят не менее чем на 500 лейкоцитов. Мазок крови будет считаться отрицательным, если исследование 1000 лейкоцитов не выявит бесполых паразитов. Плотность гаметоцитов будет рассчитываться путем подсчета количества гаметоцитов на 500 лейкоцитов.

Концентрация гемоглобина (Hb) будет измеряться в цельной крови, собранной в микрокювету с использованием Hemocue в соответствии с инструкциями производителя.

Молекулярное обнаружение P. falciparum: ДНК будет извлечена из образцов крови из пальца, собранных в микротейнеры. Молекулярное подтверждение видов Plasmodium (P.vivax, P.falciparum, P.ovale и P.malariae) в день 0 будет выполняться с помощью количественной ПЦР, направленной на рибосомный ген 18S. Тот же метод количественной ПЦР будет использоваться для выявления и количественного определения инфекций, вызванных P. falciparum, в день 0 и последующих образцов.

Генотипирование P. falciparum на предмет рецидива/новой инфекции: генотипирование рецидивирующих инфекций будет проводиться путем определения характеристик MSP1, MSP2 и GLURP, однокопийных генов в геноме Plasmodium falciparum, как описано в другом месте.

Экстракция РНК и RT-qPCR для гаметоцитов: РНК будет экстрагирована из образцов RNAprotect с использованием аффинных колонок и расщепления ДНКазой геномной ДНК. Для обнаружения и количественной оценки стадий гаметоцитов P. falciparum будет проведена количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR), нацеленная на транскрипты гена Pfs25, в день 0 и во всех последующих образцах в соответствии с ранее описанными протоколами с изменениями.

Анализы чувствительности к лекарствам ex vivo: венозная кровь, собранная в пробирки с ЭДТА/АКД (в день 0 и в день рецидива), будет обработана в течение 6 часов после сбора. Кровь центрифугируют, удаляют плазму и лейкоцитарную пленку и хранят при -20ºC. Эритроциты дважды промывали в RPMI и ресуспендировали в культуральной среде (жидкая среда RPMI 1640 LPLF) в смеси 50% гематокритной кровяной среды (BMM).

Стандартный анализ чувствительности к лекарствам ex vivo: оценка будет проводиться в соответствии с рекомендациями ВОЗ «Применение в полевых условиях анализа in vitro на чувствительность паразитов малярии человека к противомалярийным препаратам» для оценки реакции P. falciparum на артемизинины.

Анализы выживаемости на кольцевой стадии ex vivo (RSA) В дополнение к стандартным анализам ex vivo, эффективность анализов выживаемости на кольцевой стадии (RSA) будет изучаться в соответствии с опубликованным протоколом.

Молекулярные маркеры устойчивости к артемизинину: выделенная ДНК будет использоваться для генотипирования точечных мутаций в пропеллерном домене P. falciparum Kelch (K13), которые недавно были идентифицированы в качестве молекулярных маркеров устойчивости к артемизинину. Вкратце, K13 будет амплифицировать в гнездовой ПЦР с использованием праймеров, описанных в процедуре WWARN INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. После подтверждения электрофореза в агарозном геле продукты будут секвенированы и проанализированы для выявления полиморфизмов. Также могут быть изучены альтернативные будущие кандидаты на устойчивость к артемизинину. 4. ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА Посещения объектов для мониторинга будут планироваться на регулярной основе. Во время этих посещений информация, записанная в формах истории болезни (CRF), будет сверяться с первичными документами (например, лабораторными записями и больничными журналами). После того, как формы ИРК будут сопоставлены в конце испытания, они будут проверены на полноту и точность. Данные будут дважды вводиться на месте в электронную базу данных (Epi Info), где используются специально разработанные компьютерные проверки для выявления расхождений при вводе данных, неверных диапазонов данных и общей согласованности. Все несоответствия будут устранены путем ссылки на оригинальные проверенные формы сбора данных.

Все мазки крови при поступлении будут прочитаны в исследовательском центре, а также старшим микроскопистом в координационном центре. Кроме того, в ITM будет проведен внешний контроль качества 10% случайно выбранных слайдов. Для каждого из молекулярных анализов (qPCR, RT-qPCR и генотипирование паразитов) 10% образцов, обработанных в NIMPE, будут случайным образом выбраны для повторного анализа в ITM. Внешний контроль качества результатов анализа лекарств ex vivo будет проводиться в ITM, где слайды будут повторно исследованы на наличие 10% случайно выбранных изолятов.

5. План статистического анализа. Время очищения от паразитов определяется как прошедшее время (в часах) от времени лечения пациента (первой дозы) до первого из двух последовательных отрицательных мазков крови. Время и скорость очистки от паразитов, а также фаза запаздывания будут установлены с помощью онлайн-инструмента PCE, разработанного WWARN. Анализ частоты излечения за 42 дня будет проводиться как для модифицированной популяции пациентов, намеренных лечиться (mITT) (все рандомизированные пациенты), так и для оцениваемой популяции пациентов (согласно протоколу). Пациентов можно оценивать для анализа частоты излечения через 28/42 дня, если количество паразитов регистрируется до дня 26/40 или пациент прекращает лечение из-за «неудовлетворительного терапевтического эффекта» из-за повторного появления паразитов. Анализ mITT также включает пациентов, прекративших прием препарата до 28/42 дня по причинам, отличным от «неудовлетворительного терапевтического эффекта» (например, сюда могут входить «нежелательные явления» из-за повторной рвоты). Эти пациенты будут учитываться в анализе mITT как пациенты с неудачным лечением независимо от причины прекращения лечения. Пациенты, получавшие сопутствующее лечение антибиотиками, обладающими противомалярийным эффектом, будут исключены из числа подлежащих оценке пациентов и включены в mITT.

Для категориальных переменных проценты и соответствующие 95% доверительные интервалы будут рассчитываться с использованием метода Уилсона. Пропорции будут сравниваться путем вычисления *2 с поправкой Йейтса или с помощью точного критерия Фишера, где это применимо. Нормально распределенные непрерывные данные будут суммированы как средние значения и стандартные отклонения и сопоставлены с помощью t-критерия Стьюдента и дисперсионного анализа. Данные, не соответствующие нормальному распределению, суммируются как медианы (IQR) или средние геометрические и сравниваются с помощью U-критерия Манна-Уитни или дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса. Связь между двумя непрерывными переменными будет оцениваться с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Риск неэффективности лечения на 28-й и 42-й день будет оцениваться с помощью анализа выживаемости с кумулятивной заболеваемостью, рассчитанной по методу Каплана-Мейера и сравненной с помощью логарифмического рангового теста Мантеля-Хензеля.

Время очистки от паразитов, лихорадки и гаметоцитов также будет оцениваться методом Каплана Мейера.

Гематологические изменения в течение первой недели лечения, а также восстановление во время еженедельного наблюдения будут оцениваться путем измерения изменений концентрации гемоглобина между 0, 3, 7 и 14, 28 и 42 днями соответственно.

6. ЭТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ Этическое разрешение Этическое разрешение на проведение исследования будет получено от Комитета по этике Национального института маляриологии, паразитологии и энтомологии в Ханое и Университета Антверпена, а также от Институционального наблюдательного совета ITM. , Антверпен.

Информированное согласие Пациенты будут включены в исследование только в том случае, если они (или родители или опекуны детей) дадут информированное согласие. Запрос согласия доступен на английском языке и переведен на вьетнамский язык и будет полностью прочитан пациенту, родителю или опекуну. Подробная информация об испытании и его преимуществах и потенциальных рисках будет объяснена. После того, как будут даны ответы на все вопросы, на документе будет запрошена подпись. Если больной неграмотен, должен расписаться грамотный свидетель; если возможно, подписавший будет выбран участником и не будет иметь никакого отношения к исследовательской группе.