Resistência de P. Falciparum à Artemisinina no Vietnã

3.1 Desenho do estudo Este estudo foi concebido como um estudo randomizado aberto de acompanhamento de 42 dias para avaliar as respostas clínicas e parasitológicas após o tratamento de infecções não complicadas por P. falciparum com AS ou DHA-PPQ. Pacientes sintomáticos com monoinfecções por P.falciparum, preenchendo os critérios do estudo, serão incluídos no estudo, randomizados para um dos grupos de tratamento e acompanhados por 42 dias. A administração de todos os medicamentos será diretamente observada e os pacientes serão acompanhados ativamente por 42 dias de acordo com um protocolo estendido da OMS. Ao final do tempo de acompanhamento, todos os pacientes portadores de gametócitos serão tratados com uma dose única de Primaquina (0,75mg/kg) seguindo as diretrizes nacionais.

3.2. Local e população do estudo O estudo será realizado no distrito de Krong Pa, província de Gia Lai, onde as incidências de malária P.falciparum e P.vivax são as mais altas do país. O estudo será localizado na comuna de Chu R'Cam, onde a equipe do estudo trabalhará em conjunto com a equipe de saúde local e todos os centros de saúde das comunas vizinhas com pacientes com malária.

A população local é composta principalmente pela minoria étnica Gia Rai cujas ocupações principais consistem na agricultura de corte e queima (principalmente milho, mandioca e arroz) em campos florestais, juntamente com o trabalho sazonal em plantações de borracha e produção em pequena escala de bens para o dia a dia subsistência ou comércio, por ex. café e castanha de caju. O clima é tropical com estação seca de novembro a abril e estação chuvosa de maio a outubro. A área é montanhosa e arborizada (floresta secundária) e o principal vetor da malária é o Anopheles dirus.

3.4. População do ensaio A população-alvo inclui todos os doentes infectados por P. falciparum que se apresentam espontaneamente no CHC ou que são encaminhados pelo pessoal de saúde dos CHCs circundantes.

3.5. Procedimentos do ensaio 3.5.1 Triagem. Todos os pacientes de consulta que atendem aos critérios básicos de inscrição durante a triagem receberão um número de triagem consecutivo e serão avaliados em maior profundidade pelo médico. Uma vez que o paciente atenda a todos os critérios de inscrição, ele ou ela (ou um dos pais ou responsável no caso de crianças) será solicitado a consentir em participar do estudo e receberá um número de estudo (ID = numeração sequencial). Qualquer pessoa que decidir não participar do estudo será examinada, tratada e acompanhada pela equipe da unidade de saúde de acordo com o padrão de atendimento estabelecido pelo Ministério da Saúde.

3.5.2. Randomização e alocação do tratamento A randomização será realizada em blocos de 10 com uma proporção de alocação de 1:1.

Na inscrição, o paciente será entrevistado e examinado fisicamente e um questionário pré-codificado padronizado será preenchido. Uma amostra de sangue venoso será coletada em tubos vacutainer estéreis contendo EDTA ou ácido-citrato-dextrose (EDTA/ACD) de todos os pacientes no momento da inscrição. Serão coletados no mínimo 5ml de sangue -e no máximo 8ml- em adultos, e 1ml/kg até 5ml em crianças. Duas gotas de sangue serão adicionadas a um tubo de 1,5 ml contendo 500 µL de reagente RNAprotect (Qiagen).

3.5.3 Tratamento Todos os pacientes receberão um tratamento completo de AS sozinho (4mg/kg/dia) ou DHA-PPQ (dose alvo DHA=4mg/kg/dia) por 3 dias para avaliar a eliminação precoce do parasita. Uma vez que um curso de 3 dias de AS é insuficiente para tratar P.falciparum, ele será completado por um regime adicional de DHA-PPQ de 3 dias de acordo com as recomendações da OMS. Os pacientes serão observados por 60 minutos após o tratamento para reações adversas ou vômitos. Os pacientes que vomitarem a medicação nos primeiros 30 minutos receberão uma dose completa repetida; aqueles que vomitam de 30 a 60 minutos receberão meia dose.

Os medicamentos de resgate serão administrados de acordo com as diretrizes nacionais:

Droga oral de resgate: quinina (30mg/kg/dia) e clindamicina (15mg/kg/dia) por 7 dias; Droga de resgate IV: Quinina (30mg/kg/dia) e doxiciclina (3mg/kg/dia) por 7 dias 3.5.4. Acompanhamento Desde o dia 0 até a eliminação do parasita: após a primeira dose do medicamento antimalárico ter sido administrada e observada por uma hora, os pacientes serão monitorados a cada 12 horas por microscopia de sangue pelo menos até o dia 3 e mais, se necessário, até a eliminação do parasita definida como duas slides negativos consecutivos. Em cada visita, o paciente será entrevistado e examinado fisicamente, o formulário de acompanhamento preenchido e qualquer evento adverso documentado. Uma amostra de sangue por picada no dedo será coletada para os seguintes resultados: duas lâminas de sangue para observação de LM (filme grosso e fino), 200 µl de sangue em um tubo de microtainer EDTA/ACD para posterior extração de DNA e 2 gotas de sangue em outro microtainer tubo contendo RNAprotect para posterior extração de RNA. Uma gota adicional de sangue será coletada no Dia 3 para medir a concentração de Hb.

Dia 7, 14, 21, 28, 35, 42 Os pacientes serão solicitados a comparecer à clínica (ou ser visitados em casa) para cada consulta de acompanhamento, durante a qual serão entrevistados e examinados, o formulário de acompanhamento será ser concluído e qualquer evento adverso documentado. Uma amostra de sangue por picada no dedo será coletada para os seguintes resultados: duas lâminas de sangue para observação de LM (filme espesso e fino), 200μl de sangue em um tubo microtainer EDTA/ACD para extração de DNA e 2 gotas de sangue em tubo microtainer contendo RNAprotect . Nos dias 7, 14, 28 e 42, será coletada uma gota de sangue para concentração de Hb (Hemocue).

Dia da recorrência de P. falciparum A recorrência é definida como qualquer parasitemia de P. falciparum detectada pelo exame de LM durante o período de acompanhamento do paciente e após a eliminação inicial do parasita. Se a recorrência for confirmada, uma nova amostra de sangue venoso será coletada (mínimo 5ml/máximo 8ml) antes da administração do tratamento de resgate: ensaios ex-vivo serão feitos com uma parte do sangue, enquanto o restante será criopreservado para futuras investigações sobre resistência a medicamentos mecanismos.

3.5.5. Perda de acompanhamento e violações de protocolo A perda de acompanhamento ocorre quando, apesar de todos os esforços razoáveis, um paciente inscrito não comparece às consultas agendadas e não pode ser encontrado. Nenhum resultado do tratamento será atribuído a esses pacientes. Esses pacientes serão classificados como perdidos no seguimento e censurados ou excluídos da análise. Os pacientes do estudo que atenderem a qualquer um dos seguintes critérios serão classificados como desistentes: i) retirada do consentimento; ii) não conclusão do tratamento; iii) violação de inscrição; iv) violação voluntária de protocolo; v) violação involuntária de protocolo.

3.5.6 Procedimentos laboratoriais e avaliação Microscopia: três lâminas (filmes finos, grossos e finos) devem ser obtidas na triagem. Uma lâmina será corada rapidamente (10% Giemsa por 15min) para triagem inicial. Uma vez inscrito o paciente, as outras duas lâminas serão coradas com mais cuidado (3% Giemsa por 45min). A densidade do parasita será determinada contando o número de parasitas assexuados por 200 glóbulos brancos (WBCs) com um contador manual. Se mais de 500 parasitas tiverem sido contados antes de atingir 200 leucócitos, a contagem será interrompida após o preenchimento do campo. A densidade, será expressa como o número de parasitas assexuados por µl de sangue, será calculada dividindo o número de parasitas assexuados pelo número de leucócitos contados e corrigidos pela densidade estimada de leucócitos (tipicamente 8000 por µl). Quando o número de parasitas assexuados for inferior a 10 por 200 glóbulos brancos em esfregaços de acompanhamento, a contagem será feita em pelo menos 500 glóbulos brancos. Uma lâmina de sangue será considerada negativa quando o exame de 1000 glóbulos brancos não revelar nenhum parasita assexuado. A densidade de gametócitos será calculada contando o número de gametócitos por 500 leucócitos.

A concentração de hemoglobina (Hb) será medida em sangue total coletado em microcuveta usando Hemocue seguindo as instruções do fabricante.

Detecção molecular de P. falciparum: O DNA será extraído de amostras de sangue de picada no dedo coletadas em microtainers. A confirmação molecular das espécies de Plasmodium (P.vivax, P.falciparum, P.ovale e P.malariae) no dia 0 será realizada por qPCR visando o gene ribossomal 18S. O mesmo método qPCR será usado para identificar e quantificar as infecções por P. falciparum no dia 0 e acompanhar as amostras.

Genotipagem de P. falciparum para recrudescência/nova infecção: a genotipagem das infecções recorrentes será feita pela caracterização de MSP1, MSP2 e GLURP, genes de cópia única no genoma do Plasmodium falciparum conforme descrito em outro lugar.

Extração de RNA e RT-qPCR para gametócitos: O RNA será extraído de amostras de RNAprotect usando colunas de afinidade e digestão com DNAse de DNA genômico. Para detectar e quantificar os estágios dos gametócitos de P. falciparum, uma transcrição reversa qPCR (RT-qPCR) visando os transcritos do gene Pfs25 será realizada no dia 0 e em todas as amostras de acompanhamento, seguindo protocolos previamente descritos com modificações.

Ensaios ex vivo de sensibilidade a drogas: o sangue venoso coletado em tubos EDTA/ACD (no dia 0 e no dia da recorrência) será processado em até 6 horas após a coleta. O sangue será centrifugado e o plasma e a camada leucocitária removidos e armazenados a -20ºC. Os glóbulos vermelhos serão lavados duas vezes em RPMI e ressuspensos em meio de cultura (meio líquido RPMI 1640 LPLF) para uma mistura de meio de sangue hematócrito a 50% (BMM).

Ensaio de sensibilidade a medicamentos ex vivo padrão: a avaliação seguirá as diretrizes da OMS "Aplicação de campo de ensaio in vitro para a sensibilidade de parasitas da malária humana a medicamentos antimaláricos" para a avaliação da resposta de P. falciparum a artemisininas".

Ensaios de sobrevivência em estágio de anel ex vivo (RSA) Além dos ensaios ex vivo padrão, o desempenho dos ensaios de sobrevivência em estágio de anel (RSA) será explorado seguindo um protocolo publicado.

Marcadores moleculares de resistência à artemisinina: o DNA extraído será usado para genotipar mutações pontuais no domínio propulsor de P. falciparum Kelch (K13), que foram recentemente identificadas como candidatas a marcadores moleculares de resistência à artemisinina. Resumidamente, K13 será amplificado em uma PCR aninhada usando primers descritos no procedimento WWARN INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Após a confirmação da eletroforese em gel de agarose, os produtos serão sequenciados e analisados ​​para identificação de polimorfismos. Candidatos alternativos futuros para resistência à artemisinina também podem ser explorados. 4. GARANTIA DE QUALIDADE As visitas de monitoramento do local serão agendadas regularmente. Durante essas visitas, as informações registradas nos formulários de relato de caso (CRFs) serão verificadas em relação aos documentos de origem (por exemplo, registros laboratoriais e registros clínicos). Depois que os formulários dos CRFs forem reunidos no final do teste, eles serão revisados ​​quanto à integridade e precisão. Os dados serão inseridos duas vezes no local em um banco de dados eletrônico (Epi Info), onde verificações de computador especialmente projetadas são usadas para identificar discrepâncias de entrada de dados, intervalos de dados inválidos e consistência geral. Todas as discrepâncias serão resolvidas por referência aos formulários originais de coleta de dados verificados.

Todos os esfregaços de sangue na admissão serão lidos no local do estudo, bem como por um microscopista sênior em um centro coordenador. Além disso, um controle de qualidade externo será feito no ITM em 10% das lâminas selecionadas aleatoriamente. Para cada um dos ensaios moleculares (qPCR, RT-qPCR e genotipagem de parasitas) 10% das amostras processadas no NIMPE serão escolhidas aleatoriamente para serem reanalisadas no ITM. O controle de qualidade externo dos resultados do ensaio de drogas ex vivo será feito no ITM, onde as lâminas serão reexaminadas para 10% dos isolados escolhidos aleatoriamente.

5. Plano de análise estatística O tempo de eliminação do parasita é definido como o tempo decorrido (em horas) desde o tempo de tratamento do paciente (primeira dose) até a primeira de duas lâminas de sangue negativas consecutivas. O tempo e a taxa de eliminação do parasita, bem como a fase de latência, serão ajustados usando a ferramenta on-line PCE desenvolvida pela WWARN. A análise da taxa de cura de 42 dias será realizada tanto para a população de pacientes com intenção de tratar modificada (mITT) (todos os pacientes randomizados) quanto para a população de pacientes avaliáveis ​​(por protocolo). Os pacientes são avaliados para a análise da taxa de cura de 28/42 dias se as contagens de parasitas forem registradas até o dia 26/40 ou o paciente interromper devido a "efeito terapêutico insatisfatório" devido ao reaparecimento de parasitas. A análise mITT também inclui pacientes que descontinuam antes do Dia 28/42 devido a outros motivos além de "Efeito terapêutico insatisfatório" (por exemplo, isso pode incluir "Experiência(s) adversa(s)" devido a vômitos repetidos). Esses pacientes serão contados na análise mITT como falhas no tratamento, independentemente do motivo da descontinuação. Os pacientes que receberam tratamento concomitante com antibióticos com efeito antimalárico serão excluídos dos pacientes avaliáveis ​​e incluídos no mITT.

Para variáveis ​​categóricas, as porcentagens e respectivos intervalos de confiança de 95% serão calculados usando o método de Wilson. As proporções serão comparadas calculando o *2 com correção de Yates ou pelo teste exato de Fisher, quando apropriado. Dados contínuos normalmente distribuídos serão resumidos como médias e desvios padrão, e comparados pelo teste t de Student e análise de variância. Os dados que não estiverem de acordo com uma distribuição normal serão resumidos como medianas (IQR) ou médias geométricas e comparados pelo teste U de Mann-Whitney ou análise de variância de Kruskal-Wallis. A associação entre 2 variáveis ​​contínuas será avaliada por meio do coeficiente de correlação de postos de Spearman.

O risco de falha do tratamento nos dias 28 e 42 será avaliado por análise de sobrevida com incidências cumulativas calculadas pelo método Kaplan Meier e comparadas pelo teste de log rank de Mantel-Haenszel.

Os tempos de eliminação de parasitas, febre e gametócito também serão avaliados pelo método de Kaplan Meier.

As alterações hematológicas durante a primeira semana de tratamento, bem como a recuperação durante o acompanhamento semanal, serão avaliadas medindo as alterações na concentração de Hb entre os dias 0, 3, 7 e 14, 28 e 42, respectivamente.

6. QUESTÕES ÉTICAS Autorizações éticas A autorização ética para conduzir o estudo terá sido obtida do Comitê de Ética do Instituto Nacional de Malariologia, Parasitologia e Entomologia, Hanói e da Universidade de Antuérpia, bem como do Conselho de Revisão Institucional do ITM , Antuérpia.

Consentimento informado Os pacientes serão incluídos no estudo somente se eles (ou pais ou responsáveis ​​pelas crianças) derem consentimento informado. A solicitação de consentimento está disponível em inglês e traduzida para o idioma vietnamita será lida integralmente para o paciente, pai ou responsável. Detalhes sobre o estudo e seus benefícios e riscos potenciais serão explicados. Esclarecidas as dúvidas, será solicitada a assinatura no documento. Se o paciente for analfabeto, uma testemunha alfabetizada deve assinar; se possível, o signatário será escolhido pelo participante e não terá vínculo com a equipe de pesquisa.