P. Falciparum Modstand mod Artemisinin i Vietnam

3.1 Studiedesign Dette studie er designet som et randomiseret åbent 42-dages opfølgningsstudie for at evaluere de kliniske og parasitologiske responser efter behandling af ukomplicerede P.falciparum-infektioner med enten AS eller DHA-PPQ. Symptomatiske patienter med P.falciparum mono-infektioner, der opfylder undersøgelseskriterierne, vil blive optaget i undersøgelsen, randomiseret til en af ​​behandlingsarmene og fulgt op i 42 dage. Al lægemiddeladministration vil blive observeret direkte, og patienterne vil blive fulgt aktivt op i 42 dage i henhold til en udvidet WHO-protokol. Ved afslutningen af ​​opfølgningstiden vil alle patienter, der bærer gametocytter, blive behandlet med en enkelt dosis Primaquine (0,75 mg/kg) i henhold til nationale retningslinjer.

3.2. Undersøgelsessted og befolkning Undersøgelsen vil blive udført i Krong Pa-distriktet, Gia Lai-provinsen, hvor både P.falciparum og P.vivax malariaforekomster er de højeste i landet. Undersøgelsen vil blive placeret i Chu R'Cam kommune, hvor undersøgelsesholdet vil arbejde sammen med det lokale sundhedspersonale og alle omkringliggende kommuners sundhedscentre med malariapatienter.

Den lokale befolkning består hovedsageligt af det etniske mindretal Gia Rai, hvis hovederhverv består af slash and burn landbrug (hovedsageligt majs, maniok og ris) i skovmarker, sammen med sæsonarbejde i gummiplantager og småskala produktion af varer til daglig. underhold eller handel f.eks. kaffe og cashewnødder. Klimaet er tropisk med en tørre sæson fra november til april og regntiden fra maj til oktober. Området er bakket og skovklædt (sekundær skov), og den vigtigste malariavektor er Anopheles dirus.

3.4. Forsøgspopulation Målpopulationen omfatter alle P. falciparum-inficerede patienter, der enten præsenterer sig spontant til CHC eller bliver henvist af sundhedspersonalet i de omgivende CHC'er.

3.5. Forsøgsprocedurer 3.5.1 Screening. Alle konsulterende patienter, der opfylder de grundlæggende tilmeldingskriterier under screeningen, vil blive tildelt et fortløbende screeningsnummer og evalueret mere i dybden af ​​lægen. Når patienten opfylder alle tilmeldingskriterierne, vil han eller hun (eller en forælder eller værge i tilfælde af børn) blive bedt om samtykke til at deltage i undersøgelsen og vil blive tildelt et undersøgelsesnummer (ID=sekventiel nummerering). Enhver person, der beslutter sig for ikke at deltage i undersøgelsen, vil blive undersøgt, behandlet og fulgt op af sundhedsinstitutionens personale i henhold til den plejestandard, som er fastsat af Sundhedsministeriet.

3.5.2. Randomisering og behandlingstildeling Randomisering vil blive udført i blokke af 10 med et tildelingsforhold på 1:1.

Ved indskrivningen vil patienten blive interviewet og undersøgt fysisk og et standardiseret prækodet spørgeskema vil blive udfyldt. En venøs blodprøve vil blive opsamlet i sterile vacutainer-rør indeholdende EDTA eller syre-citrat-dextrose (EDTA/ACD) fra alle patienter ved tilmelding. Der vil blive indsamlet minimum 5 ml blod - og maksimalt 8 ml - fra voksne, og 1 ml/kg op til 5 ml vil blive indsamlet fra børn. To bloddråber tilsættes i et 1,5 ml rør indeholdende 500 µL RNAprotect-reagens (Qiagen).

3.5.3 Behandling Alle patienter vil modtage en fuld behandling af enten AS alene (4mg/kg/dag) eller DHA-PPQ (måldosis DHA=4mg/kg/dag) i 3 dage for at evaluere tidlig parasitclearance. Da et 3-dages forløb med AS er utilstrækkeligt til at behandle P.falciparum, vil det blive afsluttet med et yderligere 3-dages DHA-PPQ-regime i henhold til WHO's anbefalinger. Patienter vil blive observeret i 60 minutter efter behandling for bivirkninger eller opkastning. De patienter, der kaster deres medicin op inden for de første 30 minutter, vil modtage en gentagen fuld dosis; dem, der kaster op fra 30-60 minutter, vil få halv dosis.

Redningsmedicin vil blive givet følgende nationale retningslinjer:

Rednings oralt lægemiddel: Kinin (30 mg/kg/dag) og clindamycin (15 mg/kg/dag) i 7 dage; Rescue IV lægemiddel: Kinin (30 mg/kg/dag) og doxycyclin (3 mg/kg/dag) i 7 dage 3.5.4. Opfølgning Fra dag 0 indtil parasitclearance: efter at den første dosis antimalarialægemiddel er blevet administreret og observeret i en time, vil patienterne blive monitoreret hver 12. time ved blodmikroskopi mindst indtil dag 3 og længere om nødvendigt indtil parasitclearance defineret som to på hinanden følgende negative dias. Ved hvert besøg vil patienten blive interviewet og undersøgt fysisk, opfølgningsskemaet udfyldt og eventuelle uønskede hændelser dokumenteret. En blodprøve med fingerprikker vil blive indsamlet for følgende resultater: to blodglas til LM-observation (tyk og tynd film), 200 µl blod i et EDTA/ACD-mikrotainerrør til senere DNA-ekstraktion og 2 dråber blod i en anden mikrotainer rør indeholdende RNAprotect til senere RNA-ekstraktion. En ekstra dråbe blod vil blive taget på dag 3 for at måle Hb-koncentrationen.

Dag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Patienterne vil derefter blive bedt om at møde op i klinikken (eller blive besøgt hjemme) for hvert opfølgende besøg, hvor de vil blive interviewet og undersøgt, opfølgningsskemaet vil udfyldes, og enhver uønsket hændelse dokumenteres. En blodprøve med fingerprikker vil blive indsamlet for følgende resultater: to blodglas til LM-observation (tyk og tynd film), 200 μl blod i et EDTA/ACD-mikrotainerrør til DNA-ekstraktion og 2 dråber blod i RNAprotect-indeholdende mikrotainerrør . På dag 7, 14, 28 og 42 vil der blive taget en dråbe blod for Hb-koncentration (Hemocue).

Dag for tilbagefald af P. falciparum Recidiv defineres som enhver P.falciparum-parasitæmi påvist ved LM-undersøgelse under patientens opfølgningsperiode og efter initial parasitclearance. Hvis recidiv bekræftes, vil der blive udtaget en yderligere venøs blodprøve (minimum 5 ml/maksimum 8 ml) før administration af redningsbehandling: ex-vivo-analyser vil blive udført med en del af blodet, mens den resterende del vil blive kryokonserveret til fremtidige undersøgelser af lægemiddelresistens mekanismer.

3.5.5. Tab til opfølgning & protokolbrud Tab til opfølgning opstår, når en tilmeldt patient trods alle rimelige anstrengelser ikke deltager i de planlagte besøg og ikke kan findes. Ingen behandlingsresultater vil blive tildelt disse patienter. Disse patienter vil blive klassificeret som tabt til opfølgning og censureret eller udelukket fra analysen. Undersøgelsespatienter, der opfylder et af følgende kriterier, vil blive klassificeret som trukket tilbage: i) tilbagetrækning af samtykke; ii) manglende fuldførelse af behandlingen; iii) overtrædelse af tilmelding; iv) frivillig overtrædelse af protokol; v) ufrivillig protokolbrud.

3.5.6 Laboratorieprocedurer og evaluering Mikroskopi: Tre objektglas (tynde & tykke og tynde film) bør opnås ved screening. Et objektglas farves hurtigt (10 % Giemsa i 15 minutter) til indledende screening. Når patienten er indskrevet, vil de to andre objektglas blive farvet mere omhyggeligt (3 % Giemsa i 45 minutter). Parasitdensiteten bestemmes ved at tælle antallet af aseksuelle parasitter pr. 200 hvide blodlegemer (WBC'er) med en håndtæller. Hvis mere end 500 parasitter er blevet talt, før de når 200 WBCs, vil tællingen blive stoppet efter afslutning af feltet. Densitet, vil blive udtrykt som antallet af aseksuelle parasitter pr. µl blod, vil blive beregnet ved at dividere antallet af aseksuelle parasitter med antallet af WBC'er, der er talt og korrigeret med den estimerede WBC's tæthed (typisk 8000 pr. µl). Når antallet af aseksuelle parasitter er mindre end 10 pr. 200 hvide blodlegemer i opfølgende udstrygninger, vil der blive tællet mod mindst 500 hvide blodlegemer. Et blodskred vil blive betragtet som negativt, når undersøgelse af 1000 hvide blodlegemer afslører ingen aseksuelle parasitter. Gametocytdensiteten vil blive beregnet ved at tælle antallet af gametocytter pr. 500 WBC'er.

Hæmoglobin (Hb) koncentrationen vil blive målt på fuldblod opsamlet i mikro-kuvette ved hjælp af Hemocue efter producentens instruktioner.

P. falciparum molekylær påvisning: DNA vil blive ekstraheret fra fingerprikkede blodprøver indsamlet i mikrotainere. Molekylær bekræftelse af Plasmodium-arter (P.vivax, P.falciparum, P.ovale og P.malariae) på dag 0 vil blive udført ved hjælp af qPCR rettet mod 18S ribosomalt gen. Den samme qPCR-metode vil blive brugt til at identificere og kvantificere P. falciparum-infektioner på dag 0 og følge op på prøver.

P. falciparum genotypebestemmelse for gendannelse/ny infektion: genotypebestemmelse af de tilbagevendende infektioner vil blive udført ved at karakterisere MSP1, MSP2 og GLURP, enkeltkopi gener i Plasmodium falciparum genomet som beskrevet andetsteds.

RNA-ekstraktion og RT-qPCR for gametocytter: RNA vil blive ekstraheret fra RNAprotect-prøver ved hjælp af affinitetssøjler og DNAse-fordøjelse af genomisk DNA. For at påvise og kvantificere P. falciparum gametocytstadier vil en revers transkription qPCR (RT-qPCR) rettet mod Pfs25-gentranskripter blive udført på dag 0 og i alle opfølgningsprøver efter tidligere beskrevne protokoller med modifikationer.

Ex vivo lægemiddelfølsomhedsassays: venøst ​​blod opsamlet i EDTA/ACD-rør (på dag 0 og dag for tilbagefald) vil blive behandlet inden for 6 timer efter opsamling. Blod vil blive centrifugeret og plasma og buffy coat fjernet og opbevaret ved -20ºC. Røde blodlegemer vaskes to gange i RPMI og resuspenderes i dyrkningsmedium (RPMI 1640 LPLF flydende medium) til en 50 % hæmatokrit-blodmediumblanding (BMM).

Standard ex vivo-lægemiddelfølsomhedsassay: vurderingen vil følge WHO-retningslinjerne "Feltanvendelse af in vitro-assay for følsomheden af ​​humane malariaparasitter over for antimalarialægemidler" til vurdering af P. falciparums respons på artemisininer".

Ex vivo ringstadie-overlevelsesassays (RSA) Ud over standard ex vivo-assays vil ydeevnen af ​​ringstadieoverlevelsesassays (RSA) blive udforsket efter en offentliggjort protokol.

Molekylære markører for artemisininresistens: ekstraheret DNA vil blive brugt til at genotype punktmutationer i P. falciparum Kelch propellerdomæne (K13), som for nylig er blevet identificeret som kandidatresistens molekylære markører for artemisininresistens. Kort fortalt vil K13 blive amplificeret i en indlejret PCR under anvendelse af primere beskrevet i WWARN procedure INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Efter bekræftelse af agarosegelelektroforese vil produkter blive sekventeret og analyseret for at identificere polymorfismer. Alternative kommende kandidater til artemisinin-resistens kan også undersøges. 4. KVALITETSSIKRING Der vil blive planlagt besøg på stedet med jævne mellemrum. Under disse besøg vil oplysninger, der er registreret på case-rapportformularerne (CRF'er), blive verificeret i forhold til kildedokumenter (f.eks. laboratoriejournaler og klinikregistre). Efter at CRF-formularerne er samlet i slutningen af ​​forsøget, vil de blive gennemgået for fuldstændighed og nøjagtighed. Dataene vil blive dobbeltindlæst på stedet i en elektronisk database (Epi Info), hvor specialdesignede computertjek bruges til at identificere dataindtastningsuoverensstemmelser, ugyldige dataområder og overordnet konsistens. Alle uoverensstemmelser vil blive løst ved henvisning til de originale kontrollerede dataindsamlingsformularer.

Alle blodfilm ved indlæggelse vil blive læst på studiestedet samt af en seniormikroskopist på et koordinerende center. Derudover vil der blive foretaget en ekstern kvalitetskontrol hos ITM på 10 % af tilfældigt udvalgte slides. For hver af de molekylære assays (qPCR, RT-qPCR og parasit genotypebestemmelse) vil 10 % af prøverne behandlet ved NIMPE blive tilfældigt udvalgt til at blive genanalyseret ved ITM. Ekstern kvalitetskontrol af ex vivo-lægemiddelassayresultater vil blive udført på ITM, hvor objektglassene vil blive genundersøgt for 10 % af tilfældigt udvalgte isolater.

5. Plan for statistisk analyse. Parasittens clearance-tid er defineret som den forløbne tid (i timer) fra patientens behandlingstid (første dosis) til den første af to på hinanden følgende negative blodglas. Parasitrensningstid og -hastighed samt forsinkelsesfase vil blive tilpasset ved hjælp af PCE-onlineværktøjet udviklet af WWARN. Analysen af ​​42-dages helbredelsesraten vil blive udført både for den modificerede intention-to-treat (mITT) patientpopulation (alle randomiserede patienter) og den evaluerbare patientpopulation (Per Protocol). Patienter er evaluerbare til analyse af 28/42 dages helbredelseshastighed, hvis parasitantal er registreret op til dag 26/40, eller patienten afbrydes på grund af "Utilfredsstillende terapeutisk effekt" på grund af tilbagevenden af ​​parasitter. mITT-analysen inkluderer også patienter, der afbryde behandlingen før dag 28/42 på grund af andre årsager end "Utilfredsstillende terapeutisk effekt" (dette kunne f.eks. omfatte "Uønskede oplevelse(r)" på grund af gentagne opkastninger). Disse patienter vil blive truffet i mITT-analysen som behandlingssvigt uanset deres årsag til seponering. Patienter, som har fået samtidig behandling med antibiotika, som har en anti-malaria effekt, vil blive udelukket fra de evaluerbare patienter og inkluderet i mITT.

For kategoriske variable vil procenter og tilsvarende 95 % konfidensintervaller blive beregnet ved hjælp af Wilsons metode. Proportioner vil blive sammenlignet ved at beregne *2 med Yates' korrektion eller ved Fishers eksakte test, hvor det er relevant. Normalfordelte kontinuerlige data vil blive opsummeret som middelværdier og standardafvigelser og sammenlignet med Students t-test og variansanalyse. Data, der ikke er i overensstemmelse med en normalfordeling, vil blive opsummeret som medianer (IQR) eller geometriske middelværdier og sammenlignet med Mann-Whitney U-testen eller Kruskal-Wallis-variansanalysen. Sammenhængen mellem 2 kontinuerte variable vil blive vurderet ved hjælp af Spearmans rangkorrelationskoefficient.

Risikoen for behandlingssvigt på dag 28 og 42 vil alle blive evalueret ved overlevelsesanalyse med kumulative forekomster beregnet ved Kaplan Meier-metoden og sammenlignet med Mantel-Haenszel log rank test.

Parasit-, feber- og gametocytclearancetider vil også blive evalueret ved Kaplan Meier-metoden.

Hæmatologiske ændringer i løbet af den første uge af behandlingen samt restitution under ugentlig opfølgning vil blive evalueret ved at måle ændringerne i Hb-koncentrationen mellem henholdsvis dag 0, 3, 7 og dag 14, 28 og 42.

6. ETISKE SPØRGSMÅL Etiske godkendelser Etisk godkendelse til at udføre undersøgelsen vil være opnået fra den etiske komité for National Institute of Malariology, Parasitology and Entomology, Hanoi og fra University of Antwerpen, samt fra Institutional Review Board ved ITM , Antwerpen.

Informeret samtykke Patienter vil kun blive inkluderet i undersøgelsen, hvis de (eller forældre eller værger til børn) giver informeret samtykke. Anmodningen om samtykke er tilgængelig på engelsk og oversat til vietnamesisk sprog vil blive læst helt op for patienten, forælderen eller værgen. Detaljer om forsøget og dets fordele og potentielle risici vil blive forklaret. Når eventuelle spørgsmål er besvaret, vil der blive anmodet om en underskrift på dokumentet. Hvis patienten er analfabet, skal et læse- og skrivevidne skrive under; hvis det er muligt, vil underskriveren blive udvalgt af deltageren og vil ikke have nogen forbindelse til forskerholdet.