P. Falciparum Rezistence k Artemisininu ve Vietnamu

3.1 Uspořádání studie Tato studie je navržena jako randomizovaná otevřená 42denní následná studie k vyhodnocení klinických a parazitologických odpovědí po léčbě nekomplikovaných infekcí P. falciparum buď AS nebo DHA-PPQ. Symptomatičtí pacienti s monoinfekcemi P. falciparum splňující kritéria studie budou zařazeni do studie, randomizováni do jednoho z léčebných ramen a sledováni po dobu 42 dnů. Veškeré podávání léků bude přímo sledováno a pacienti budou aktivně sledováni po dobu 42 dnů podle rozšířeného protokolu WHO. Na konci doby sledování budou všichni pacienti s gametocyty léčeni jednou dávkou Primaquinu (0,75 mg/kg) podle národních směrnic.

3.2. Místo studie a populace Studie bude provedena v okrese Krong Pa v provincii Gia Lai, kde je výskyt malárie P. falciparum i P. vivax nejvyšší v zemi. Studie bude umístěna v obci Chu R'Cam, kde bude studijní tým spolupracovat s místním zdravotnickým personálem a všemi okolními zdravotnickými středisky obcí s pacienty s malárií.

Místní obyvatelstvo je tvořeno převážně etnickou menšinou Gia Rai, jejíž hlavní profesí je sekání a vypalování zemědělství (zejména kukuřice, manioku a rýže) na lesních polích, sezónní práce na kaučukových plantážích a drobná výroba zboží denní potřeby. živobytí nebo živnost např. kávu a kešu oříšky. Podnebí je tropické s obdobím sucha od listopadu do dubna a obdobím dešťů od května do října. Oblast je kopcovitá a zalesněná (sekundární les) a hlavním přenašečem malárie je Anopheles dirus.

3.4. Populace ve studii Cílová populace zahrnuje všechny pacienty infikované P. falciparum, kteří buď spontánně přišli do CHC, nebo byli odesláni zdravotnickým personálem okolních CHC.

3.5. Zkušební postupy 3.5.1 Screening. Všem konzultujícím pacientům, kteří při screeningu splní základní vstupní kritéria, bude přiděleno průběžné screeningové číslo a bude lékařem hlouběji hodnoceno. Jakmile pacient splní všechna registrační kritéria, bude on nebo ona (nebo jeho rodič nebo opatrovník v případě dětí) požádán o souhlas s účastí ve studii a bude mu přiděleno číslo studie (ID = pořadové číslování). Každá osoba, která se rozhodne studie neúčastnit, bude vyšetřena, ošetřena a sledována pracovníky zdravotnického zařízení podle standardu péče stanoveného Ministerstvem zdravotnictví.

3.5.2. Randomizace a alokace ošetření Randomizace bude prováděna v blocích po 10 s poměrem alokace 1:1.

Při zápisu bude pacient vyslechnut a fyzicky vyšetřen a bude vyplněn standardizovaný předem kódovaný dotazník. Vzorek žilní krve bude odebrán do sterilních vacutainerových zkumavek obsahujících EDTA nebo acid-citrát-dextrózu (EDTA/ACD) od všech pacientů při zařazení. Dospělým bude odebráno minimálně 5 ml krve – a maximálně 8 ml – a dětem 1 ml/kg až 5 ml. Dvě kapky krve se přidají do 1,5 ml zkumavky obsahující 500 µl činidla RNAprotect (Qiagen).

3.5.3 Léčba Všichni pacienti dostanou plnou léčbu buď samotným AS (4 mg/kg/den) nebo DHA-PPQ (cílová dávka DHA = 4 mg/kg/den) po dobu 3 dnů, aby bylo možné vyhodnotit časné vymizení parazitů. Vzhledem k tomu, že 3denní kúra AS nestačí k léčbě P.falciparum, bude doplněna dalším 3denním režimem DHA-PPQ podle doporučení WHO. Pacienti budou sledováni po dobu 60 minut po léčbě kvůli nežádoucím reakcím nebo zvracení. Pacienti zvracející léky během prvních 30 minut dostanou opakovanou plnou dávku; ti, kteří zvracejí od 30-60 minut, dostanou poloviční dávku.

Záchranné léky budou podávány podle národních pokynů:

Záchranný perorální lék: chinin (30 mg/kg/den) a klindamycin (15 mg/kg/den) po dobu 7 dnů; Záchranný IV lék: Chinin (30 mg/kg/den) a doxycyklin (3 mg/kg/den) po dobu 7 dnů 3.5.4. Sledování Ode dne 0 až do vymizení parazitů: po podání první dávky antimalarika a pozorování po dobu jedné hodiny budou pacienti sledováni každých 12 hodin krevní mikroskopií nejméně do 3. dne a v případě potřeby déle, dokud se parazity nezbaví definované jako dva po sobě jdoucí negativní diapozitivy. Při každé návštěvě bude pacient vyslechnut a fyzicky vyšetřen, bude vyplněn kontrolní formulář a zdokumentovány všechny nežádoucí příhody. Vzorek krve z píchnutí prstu bude odebrán pro následující výsledky: dvě krevní sklíčka pro pozorování LM (silný a tenký film), 200 µl krve do zkumavky EDTA/ACD pro pozdější extrakci DNA a 2 kapky krve do jiné mikronádobky zkumavka obsahující RNAprotect pro pozdější extrakci RNA. Další kapka krve bude odebrána 3. den pro měření koncentrace Hb.

7., 14., 21., 28., 35., 42. den Pacienti budou poté vyzváni, aby se dostavili na kliniku (nebo byli navštíveni doma) při každé následné návštěvě, během níž budou pohovory a vyšetření, kontrolní formulář bude být dokončena a zdokumentována jakákoli nežádoucí příhoda. Vzorek krve z píchnutí prstu bude odebrán pro následující výsledky: dvě krevní sklíčka pro pozorování LM (tlustý a tenký film), 200 μl krve v EDTA/ACD mikrotainerové zkumavce pro extrakci DNA a 2 kapky krve do mikrotainerové zkumavky obsahující RNAprotect . 7., 14., 28. a 42. den bude odebrána jedna kapka krve na koncentraci Hb (Hemocue).

Den recidivy P. falciparum Recidivou se rozumí jakákoliv parazitémie P. falciparum zjištěná vyšetřením LM během období sledování pacienta a po počátečním odstranění parazitů. Pokud se potvrdí recidiva, bude před podáním záchranné léčby odebrán další vzorek žilní krve (minimálně 5 ml/maximálně 8 ml): ex-vivo testy budou provedeny s jednou částí krve, zatímco zbývající bude kryokonzervována pro budoucí výzkumy rezistence na léky mechanismy.

3.5.5. Ztráta sledování a porušení protokolu Ke ztrátě sledování dochází, když se zapsaný pacient přes veškeré přiměřené úsilí nedostaví na plánované návštěvy a nemůže být nalezen. Těmto pacientům nebude přidělen žádný výsledek léčby. Tito pacienti budou klasifikováni jako ztracení pro sledování a cenzurováni nebo vyloučeni z analýzy. Pacienti ve studii, kteří splňují kterékoli z následujících kritérií, budou klasifikováni jako odvolaní: i) odvolání souhlasu; ii) nedokončení léčby; iii) porušení registrace; iv) dobrovolné porušení protokolu; v) nedobrovolné porušení protokolu.

3.5.6 Laboratorní postupy a hodnocení Mikroskopie: při screeningu by měla být získána tři sklíčka (tenká, tlustá a tenká vrstva). Jedno sklíčko se rychle obarví (10% Giemsa po dobu 15 minut) pro počáteční screening. Jakmile je pacient zařazen, další dvě sklíčka budou obarvena pečlivěji (3% Giemsa po dobu 45 minut). Hustota parazitů bude určena spočítáním počtu asexuálních parazitů na 200 bílých krvinek (WBC) pomocí ručního počítadla. Pokud bylo napočítáno více než 500 parazitů před dosažením 200 WBC, počítání bude zastaveno po dokončení pole. Hustota, bude vyjádřena jako počet asexuálních parazitů na µl krve, bude vypočtena vydělením počtu asexuálních parazitů počtem spočítaných bílých krvinek a korigována odhadovanou hustotou bílých krvinek (typicky 8000 na µl). Když je počet asexuálních parazitů nižší než 10 na 200 bílých krvinek v kontrolních nátěrech, provede se počítání proti nejméně 500 bílým krvinkám. Krevní sklíčko bude považováno za negativní, když vyšetření 1000 bílých krvinek neodhalí žádné asexuální parazity. Hustota gametocytů bude vypočítána spočtením počtu gametocytů na 500 bílých krvinek.

Koncentrace hemoglobinu (Hb) bude měřena v plné krvi odebrané do mikrokyvety pomocí Hemocue podle pokynů výrobce.

Molekulární detekce P. falciparum: DNA bude extrahována ze vzorků krve z prstů odebraných do mikronádob. Molekulární potvrzení druhů Plasmodium (P.vivax, P.falciparum, P.ovale a P.malariae) v den 0 bude provedeno pomocí qPCR zacílené na 18S ribozomální gen. Stejná metoda qPCR bude použita k identifikaci a kvantifikaci infekcí P. falciparum v den 0 a ke sledování vzorků.

Genotypizace P. falciparum pro rekultivaci/novou infekci: genotypizace rekurentních infekcí bude provedena charakterizací MSP1, MSP2 a GLURP, jednokopiových genů v genomu Plasmodium falciparum, jak je popsáno jinde.

Extrakce RNA a RT-qPCR pro gametocyty: RNA bude extrahována ze vzorků RNAprotect pomocí afinitních kolon a štěpení genomové DNA DNAázou. Pro detekci a kvantifikaci stádií gametocytů P. falciparum bude provedena reverzní transkripce qPCR (RT-qPCR) zacílená na transkripty genu Pfs25 v den 0 a ve všech následných vzorcích podle dříve popsaných protokolů s modifikacemi.

Ex vivo testy citlivosti na léky: venózní krev odebraná do zkumavek EDTA/ACD (v den 0 a den recidivy) bude zpracována do 6 hodin po odběru. Krev bude odstředěna a plazma a buffy coat odstraněny a skladovány při -20ºC. Červené krvinky budou dvakrát promyty v RPMI a resuspendovány v kultivačním médiu (RPMI 1640 LPLF kapalné médium) na 50% hematokritovou směs krevního média (BMM).

Standardní ex vivo test citlivosti na léčivo: hodnocení se bude řídit pokyny WHO „Terénní aplikace in vitro testu citlivosti lidských parazitů malárie na antimalarika“ pro hodnocení odpovědi P. falciparum na artemisininy“.

Ex vivo testy přežití ve stadiu kruhů (RSA) Kromě standardních testů ex vivo bude podle zveřejněného protokolu prozkoumána účinnost testů přežití v kruhovém stádiu (RSA).

Molekulární markery artemisininové rezistence: extrahovaná DNA bude použita ke genotypování bodových mutací v Kelchově vrtulové doméně P. falciparum (K13), které byly nedávno identifikovány jako kandidátní molekulární markery rezistence pro artemisininovou rezistenci. Krátce, K13 bude amplifikován v nested PCR s použitím primerů popsaných v WWARN postupu INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Po potvrzení elektroforézou na agarózovém gelu budou produkty sekvenovány a analyzovány k identifikaci polymorfismů. Mohou být také prozkoumáni alternativní kandidáti na artemisininovou rezistenci. 4. ZAJIŠTĚNÍ KVALITY Monitorovací návštěvy na místě budou naplánovány pravidelně. Během těchto návštěv budou informace zaznamenané na formulářích kazuistik (CRF) ověřeny se zdrojovými dokumenty (např. laboratorní záznamy a registry klinik). Po seřazení formulářů CRF na konci pokusu budou zkontrolovány jejich úplnost a přesnost. Data budou na místě dvakrát vložena do elektronické databáze (Epi Info), kde se používají speciálně navržené počítačové kontroly k identifikaci nesrovnalostí v zadávání dat, neplatných rozsahů dat a celkové konzistence. Všechny nesrovnalosti budou vyřešeny odkazem na původní zkontrolované formuláře pro sběr dat.

Všechny krevní filmy při přijetí budou odečteny v místě studie a také starším mikroskopem v koordinačním centru. Kromě toho bude v ITM provedena externí kontrola kvality u 10 % náhodně vybraných snímků. Pro každý z molekulárních testů (qPCR, RT-qPCR a genotypizace parazitů) bude náhodně vybráno 10 % vzorků zpracovaných v NIMPE, které budou znovu analyzovány v ITM. Ex vivo kontrola kvality výsledků ex vivo testů léků bude provedena na ITM, kde budou sklíčka znovu vyšetřena na 10 % náhodně vybraných izolátů.

5. Plán statistické analýzy Doba odstranění parazita je definována jako doba (v hodinách), která uplynula od doby léčby pacienta (první dávka) do prvního ze dvou po sobě jdoucích negativních krevních preparátů. Doba a rychlost odstranění parazitů a také fáze zpoždění budou nastaveny pomocí online nástroje PCE vyvinutého organizací WWARN. Analýza 42denního vyléčení bude provedena jak pro populaci pacientů s modifikovaným záměrem léčby (mITT) (všichni randomizovaní pacienti), tak pro hodnotitelnou populaci pacientů (podle protokolu). Pacienti jsou hodnotitelní pro analýzu míry vyléčení za 28/42 dní, pokud jsou počty parazitů zaznamenávány do 26./40. dne nebo pokud pacient přeruší léčbu kvůli "neuspokojivému terapeutickému účinku" kvůli opětovnému výskytu parazitů. Analýza mITT také zahrnuje pacienty, kteří přeruší léčbu před 28./42. dnem z jiných důvodů než „Neuspokojivý terapeutický účinek“ (např. to může zahrnovat „Nežádoucí zkušenosti“ kvůli opakovanému zvracení). Tito pacienti budou počítáni v mITT analýze jako selhání léčby bez ohledu na důvod jejich přerušení. Pacienti, kteří byli současně léčeni antibiotiky, která mají antimalarický účinek, budou vyloučeni z hodnotitelných pacientů a zahrnuti do mITT.

Pro kategorické proměnné budou pomocí Wilsonovy metody vypočteny procenta a odpovídající 95% intervaly spolehlivosti. Proporce budou porovnány výpočtem *2 s Yatesovou korekcí nebo Fisherovým přesným testem, kde je to vhodné. Normálně rozložená spojitá data budou shrnuta jako průměry a standardní odchylky a porovnána Studentovým t testem a analýzou rozptylu. Data neodpovídající normální distribuci budou shrnuta jako mediány (IQR) nebo geometrické průměry a porovnána Mann-Whitney U testem nebo Kruskal-Wallisovou analýzou rozptylu. Asociace mezi 2 spojitými proměnnými bude posouzena pomocí Spearmanova koeficientu pořadové korelace.

Riziko selhání léčby do 28. a 42. dne bude vyhodnoceno analýzou přežití s ​​kumulativní incidencí vypočítanou metodou Kaplan Meier a porovnáno Mantel-Haenszel log rank testem.

Časy clearance parazitů, horečky a gametocytů budou také hodnoceny metodou Kaplan Meier.

Hematologické změny během prvního týdne léčby a také zotavení během týdenního sledování budou hodnoceny měřením změn koncentrace Hb mezi dnem 0, 3, 7 a dnem 14, 28 a 42, v tomto pořadí.

6. ETICKÉ OTÁZKY Etické prověrky Etická prověrka pro provedení studie bude získána od Etického výboru Národního institutu malariologie, parazitologie a entomologie v Hanoji a Antverpské univerzity, jakož i od Institucionální revizní rady ITM. , Antverpy.

Informovaný souhlas Pacienti budou zařazeni do studie pouze tehdy, pokud oni (nebo rodiče či opatrovníci dětí) dají informovaný souhlas. Žádost o souhlas je k dispozici v angličtině a přeložená do vietnamského jazyka bude celá přečtena pacientovi, rodiči nebo opatrovníkovi. Budou vysvětleny podrobnosti o studii a jejích přínosech a potenciálních rizicích. Jakmile budou zodpovězeny jakékoli dotazy, bude vyžadován podpis na dokumentu. Je-li pacient negramotný, musí se podepsat gramotný svědek; pokud je to možné, signatář bude vybrán účastníkem a nebude mít žádné spojení s výzkumným týmem.