Resistencia de P. falciparum a la artemisinina en Vietnam

3.1 Diseño del estudio Este estudio está diseñado como un estudio de seguimiento aleatorizado y abierto de 42 días para evaluar las respuestas clínicas y parasitológicas después del tratamiento de infecciones no complicadas por P. falciparum con AS o DHA-PPQ. Los pacientes sintomáticos con monoinfecciones por P. falciparum que cumplan los criterios del estudio se inscribirán en el estudio, se aleatorizarán a uno de los brazos de tratamiento y se les hará un seguimiento durante 42 días. Se observará directamente toda la administración de medicamentos y se realizará un seguimiento activo de los pacientes durante 42 días de acuerdo con un protocolo ampliado de la OMS. Al final del tiempo de seguimiento, todos los pacientes portadores de gametocitos serán tratados con una dosis única de primaquina (0,75 mg/kg) siguiendo las directrices nacionales.

3.2. Sitio y población del estudio El estudio se llevará a cabo en el distrito de Krong Pa, provincia de Gia Lai, donde las incidencias de paludismo por P.falciparum y P.vivax son las más altas del país. El estudio se ubicará en la comuna de Chu R'Cam, donde el equipo del estudio trabajará junto con el personal de salud local y todos los centros de salud de las comunas circundantes con pacientes de malaria.

La población local está compuesta principalmente por la minoría étnica Gia Rai, cuyas principales ocupaciones consisten en la agricultura de tala y quema (principalmente maíz, mandioca y arroz) en campos forestales, junto con el trabajo estacional en las plantaciones de caucho y la producción a pequeña escala de bienes para el consumo diario. subsistencia o comercio, p. café y anacardos. El clima es tropical con una estación seca de noviembre a abril y una estación lluviosa de mayo a octubre. El área es montañosa y boscosa (bosque secundario) y el principal vector de malaria es Anopheles dirus.

3.4. Población del ensayo La población diana incluye a todos los pacientes infectados por P. falciparum que acuden espontáneamente al CHC o que son remitidos por el personal sanitario de los CHC circundantes.

3.5. Procedimientos de prueba 3.5.1 Selección. A todos los pacientes de consulta que cumplan con los criterios básicos de inscripción durante la selección se les asignará un número de selección consecutivo y el médico los evaluará con mayor profundidad. Una vez que el paciente cumpla con todos los criterios de inscripción, a él o ella (o a un padre o tutor en el caso de niños) se le pedirá su consentimiento para participar en el estudio y se le asignará un número de estudio (ID = numeración secuencial). Toda persona que decida no participar en el estudio será examinada, tratada y acompañada por el personal del establecimiento de salud de acuerdo con el estándar de atención establecido por el Ministerio de Salud.

3.5.2. Aleatorización y asignación del tratamiento La asignación al azar se realizará en bloques de 10 con una proporción de asignación de 1:1.

En el momento de la inscripción, el paciente será entrevistado y examinado físicamente y se completará un cuestionario precodificado estandarizado. Se recogerá una muestra de sangre venosa en tubos vacutainer estériles que contengan EDTA o ácido-citrato-dextrosa (EDTA/ACD) de todos los pacientes en el momento de la inscripción. Se recogerá un mínimo de 5ml de sangre -y un máximo de 8ml- de adultos, y de 1ml/kg hasta 5ml de niños. Se agregarán dos gotas de sangre en un tubo de 1,5 ml que contiene 500 µl de reactivo RNAprotect (Qiagen).

3.5.3 Tratamiento Todos los pacientes recibirán un tratamiento completo de AS solo (4 mg/kg/día) o DHA-PPQ (dosis objetivo de DHA = 4 mg/kg/día) durante 3 días para evaluar la eliminación temprana del parásito. Dado que un curso de 3 días de AS es insuficiente para tratar P. falciparum, se completará con un régimen adicional de 3 días de DHA-PPQ de acuerdo con las recomendaciones de la OMS. Se observará a los pacientes durante 60 minutos después del tratamiento para detectar reacciones adversas o vómitos. Aquellos pacientes que vomiten su medicamento dentro de los primeros 30 minutos recibirán una dosis completa repetida; aquellos que vomiten de 30 a 60 minutos recibirán la mitad de la dosis.

Los medicamentos de rescate se administrarán siguiendo las pautas nacionales:

Fármaco oral de rescate: Quinina (30 mg/kg/día) y clindamicina (15 mg/kg/día) durante 7 días; Fármaco IV de rescate: Quinina (30 mg/kg/día) y doxiciclina (3 mg/kg/día) durante 7 días 3.5.4. Seguimiento Desde el día 0 hasta la eliminación del parásito: después de que se haya administrado la primera dosis del fármaco antipalúdico y se haya observado durante una hora, los pacientes serán monitoreados cada 12 horas mediante microscopía de sangre al menos hasta el día 3 y más si es necesario hasta la eliminación del parásito definida como dos diapositivas negativas consecutivas. En cada visita, el paciente será entrevistado y examinado físicamente, se completará el formulario de seguimiento y se documentará cualquier evento adverso. Se recolectará una muestra de sangre por punción digital para los siguientes resultados: dos láminas de sangre para la observación de LM (película gruesa y delgada), 200 µl de sangre en un tubo microtainer EDTA/ACD para la posterior extracción de ADN y 2 gotas de sangre en otro microtainer tubo que contiene RNAprotect para la posterior extracción de RNA. Se tomará una gota adicional de sangre el día 3 para medir la concentración de Hb.

Día 7, 14, 21, 28, 35, 42 Luego se les pedirá a los pacientes que asistan a la clínica (o que los visiten en su casa) para cada visita de seguimiento, durante la cual serán entrevistados y examinados, el formulario de seguimiento se ser completado, y cualquier evento adverso documentado. Se recolectará una muestra de sangre por punción digital para los siguientes resultados: dos portaobjetos de sangre para la observación de LM (película gruesa y delgada), 200 μl de sangre en un tubo microtainer con EDTA/ACD para la extracción de ADN y 2 gotas de sangre en un tubo microtainer que contiene RNAprotect . Los días 7, 14, 28 y 42 se tomará una gota de sangre para la concentración de Hb (Hemocue).

Día de la recurrencia de P. falciparum La recurrencia se define como cualquier parasitemia por P. falciparum detectada mediante examen LM durante el período de seguimiento del paciente y después de la eliminación inicial del parásito. Si se confirma la recurrencia, se recogerá una muestra de sangre venosa adicional (mínimo 5 ml/máximo 8 ml) antes de la administración del tratamiento de rescate: se realizarán ensayos ex vivo con una parte de la sangre, mientras que el resto se crioconservará para futuras investigaciones sobre la resistencia a los medicamentos. mecanismos

3.5.5. Pérdida de seguimiento y violaciones del protocolo La pérdida de seguimiento ocurre cuando, a pesar de todos los esfuerzos razonables, un paciente inscrito no asiste a las visitas programadas y no se puede encontrar. No se asignará ningún resultado del tratamiento a estos pacientes. Estos pacientes serán clasificados como perdidos de seguimiento y censurados o excluidos del análisis. Los pacientes del estudio que cumplan con alguno de los siguientes criterios se clasificarán como retirados: i) retiro del consentimiento; ii) falta de completar el tratamiento; iii) violación de inscripción; iv) violación del protocolo voluntario; v) violación involuntaria del protocolo.

3.5.6 Procedimientos de laboratorio y evaluación Microscopía: se deben obtener tres portaobjetos (películas delgadas y gruesas y delgadas) en la selección. Un portaobjetos se tiñerá rápidamente (10 % Giemsa durante 15 min) para la selección inicial. Una vez inscrito el paciente, los otros dos portaobjetos se teñirán con más cuidado (3% Giemsa durante 45 min). La densidad de parásitos se determinará contando el número de parásitos asexuales por cada 200 glóbulos blancos (WBC) con un contador manual. Si se han contado más de 500 parásitos antes de llegar a 200 glóbulos blancos, el conteo se detendrá después de completar el campo. La densidad, se expresará como el número de parásitos asexuales por µl de sangre, se calculará dividiendo el número de parásitos asexuales por el número de glóbulos blancos contados y corregidos por la densidad estimada de glóbulos blancos (típicamente 8000 por µl). Cuando el número de parásitos asexuales sea inferior a 10 por 200 glóbulos blancos en los frotis de seguimiento, el recuento se realizará contra al menos 500 glóbulos blancos. Un frotis de sangre se considerará negativo cuando el examen de 1000 glóbulos blancos no revele parásitos asexuales. La densidad de gametocitos se calculará contando el número de gametocitos por 500 glóbulos blancos.

La concentración de hemoglobina (Hb) se medirá en sangre completa recolectada en una microcubeta usando Hemocue siguiendo las instrucciones del fabricante.

Detección molecular de P. falciparum: el ADN se extraerá de muestras de sangre por punción digital recolectadas en microtainers. La confirmación molecular de especies de Plasmodium (P.vivax, P.falciparum, P.ovale y P.malariae) en el día 0 se realizará mediante qPCR dirigida al gen ribosomal 18S. Se utilizará el mismo método de qPCR para identificar y cuantificar las infecciones por P. falciparum en el día 0 y las muestras de seguimiento.

Genotipificación de P. falciparum para el recrudecimiento/nueva infección: la genotipificación de las infecciones recurrentes se realizará mediante la caracterización de los genes de copia única MSP1, MSP2 y GLURP en el genoma de Plasmodium falciparum, como se describe en otra parte.

Extracción de ARN y RT-qPCR para gametocitos: el ARN se extraerá de las muestras de RNAprotect mediante columnas de afinidad y digestión con ADNsa del ADN genómico. Para detectar y cuantificar las etapas de gametocitos de P. falciparum, se realizará una qPCR de transcripción inversa (RT-qPCR) dirigida a las transcripciones del gen Pfs25 el día 0 y en todas las muestras de seguimiento, siguiendo los protocolos descritos anteriormente con modificaciones.

Ensayos de sensibilidad a fármacos ex vivo: la sangre venosa recolectada en tubos EDTA/ACD (en el Día 0 y el Día de la recurrencia) se procesará dentro de las 6 horas posteriores a la recolección. Se centrifugará la sangre y se extraerán el plasma y la capa leucocítica y se almacenarán a -20ºC. Los glóbulos rojos se lavarán dos veces en RPMI y se resuspenderán en medio de cultivo (medio líquido RPMI 1640 LPLF) hasta una mezcla de medio sanguíneo (BMM) con hematocrito al 50 %.

Ensayo estándar de sensibilidad a fármacos ex vivo: la evaluación seguirá las directrices de la OMS "Aplicación de campo del ensayo in vitro para determinar la sensibilidad de los parásitos del paludismo humano a los fármacos antipalúdicos" para la evaluación de la respuesta de P. falciparum a las artemisininas.

Ensayos de supervivencia en etapa anular (RSA) ex vivo Además de los ensayos ex vivo estándar, se explorará el rendimiento de los ensayos de supervivencia en etapa anular (RSA) siguiendo un protocolo publicado.

Marcadores moleculares de resistencia a la artemisinina: el ADN extraído se utilizará para genotipar mutaciones puntuales en el dominio de hélice Kelch de P. falciparum (K13), que recientemente se identificaron como marcadores moleculares de resistencia candidatos para la resistencia a la artemisinina. Brevemente, K13 se amplificará en una PCR anidada utilizando los cebadores descritos en el procedimiento INV11 de WWARN [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Después de la confirmación por electroforesis en gel de agarosa, los productos se secuenciarán y analizarán para identificar polimorfismos. También se pueden explorar candidatos futuros alternativos para la resistencia a la artemisinina. 4. GARANTÍA DE CALIDAD Se programarán visitas de monitoreo del sitio de manera regular. Durante estas visitas, la información registrada en los formularios de informe de casos (CRF) se verificará con los documentos originales (por ejemplo, registros de laboratorio y registros clínicos). Después de que los formularios CRF se cotejen al final del ensayo, se revisarán para verificar que estén completos y precisos. Los datos se ingresarán dos veces en el sitio en una base de datos electrónica (Epi Info), donde se utilizan controles informáticos especialmente diseñados para identificar discrepancias en el ingreso de datos, rangos de datos no válidos y consistencia general. Todas las discrepancias se resolverán por referencia a los formularios originales de recopilación de datos verificados.

Todos los frotis de sangre al ingreso serán leídos en el sitio del estudio, así como por un microscopista senior en un centro de coordinación. Además, se realizará un control de calidad externo en el ITM sobre el 10% de los portaobjetos seleccionados aleatoriamente. Para cada uno de los ensayos moleculares (qPCR, RT-qPCR y genotipado de parásitos), el 10 % de las muestras procesadas en NIMPE se elegirán aleatoriamente para volver a analizarlas en ITM. El control de calidad externo de los resultados de los ensayos de fármacos ex vivo se realizará en ITM, donde se volverán a examinar los portaobjetos para el 10 % de los aislamientos elegidos al azar.

5. Plan de análisis estadístico El tiempo de eliminación del parásito se define como el tiempo transcurrido (en horas) desde el tratamiento del paciente (primera dosis) hasta el primero de dos frotis de sangre negativos consecutivos. El tiempo y la tasa de eliminación de parásitos, así como la fase de retraso, se ajustarán utilizando la herramienta en línea PCE desarrollada por WWARN. El análisis de la tasa de curación a los 42 días se realizará tanto para la población de pacientes con intención de tratar modificada (mITT) (todos los pacientes aleatorizados) como para la población de pacientes evaluable (por protocolo). Los pacientes son evaluables para el análisis de la tasa de curación de 28/42 días si se registran recuentos de parásitos hasta el día 26/40 o si el paciente interrumpe el tratamiento debido a un "efecto terapéutico insatisfactorio" debido a la reaparición de parásitos. El análisis mITT también incluye pacientes que interrumpieron antes del día 28/42 por razones distintas a "Efecto terapéutico insatisfactorio" (p. ej., esto podría incluir "Experiencia(s) adversa(s)" debido a vómitos repetidos). Estos pacientes se contarán en el análisis mITT como fracasos del tratamiento, independientemente del motivo de la interrupción. Los pacientes que hayan recibido tratamiento concomitante con antibióticos con efecto antipalúdico serán excluidos de los pacientes evaluables e incluidos en el mITT.

Para las variables categóricas, los porcentajes y los correspondientes intervalos de confianza del 95 % se calcularán utilizando el método de Wilson. Las proporciones se compararán calculando el *2 con la corrección de Yates o mediante la prueba exacta de Fisher, según corresponda. Los datos continuos distribuidos normalmente se resumirán como medias y desviaciones estándar, y se compararán mediante la prueba t de Student y el análisis de varianza. Los datos que no se ajusten a una distribución normal se resumirán como medianas (IQR) o medias geométricas y se compararán mediante la prueba U de Mann-Whitney o el análisis de varianza de Kruskal-Wallis. La asociación entre 2 variables continuas se evaluará mediante el coeficiente de correlación de rangos de Spearman.

El riesgo de fracaso del tratamiento para los días 28 y 42 se evaluará mediante análisis de supervivencia con incidencias acumuladas calculadas mediante el método de Kaplan Meier y comparadas mediante la prueba de rango logarítmico de Mantel-Haenszel.

Los tiempos de aclaramiento de parásitos, fiebre y gametocitos también serán evaluados por el método de Kaplan Meier.

Los cambios hematológicos durante la primera semana de tratamiento así como la recuperación durante el seguimiento semanal se evaluarán midiendo los cambios en la concentración de Hb entre los días 0, 3, 7 y los días 14, 28 y 42, respectivamente.

6. CUESTIONES ÉTICAS Autorizaciones éticas La autorización ética para realizar el estudio se habrá obtenido del Comité de Ética del Instituto Nacional de Malariología, Parasitología y Entomología de Hanoi y de la Universidad de Amberes, así como de la Junta de Revisión Institucional del ITM. , Amberes.

Consentimiento informado Los pacientes serán incluidos en el estudio solo si ellos (o los padres o tutores de los niños) dan su consentimiento informado. La solicitud de consentimiento está disponible en inglés y traducida al idioma vietnamita se leerá en su totalidad al paciente, padre o tutor. Se explicarán los detalles sobre el ensayo y sus beneficios y riesgos potenciales. Una vez respondidas las preguntas, se solicitará una firma en el documento. Si el paciente es analfabeto, debe firmar un testigo alfabetizado; si es posible, el firmante será seleccionado por el participante y no tendrá conexión con el equipo de investigación.