P. Falciparum Resistenz gegen Artemisinin in Vietnam

3.1 Studiendesign Diese Studie ist als randomisierte Open-Label-Follow-up-Studie über 42 Tage konzipiert, um das klinische und parasitologische Ansprechen nach der Behandlung von unkomplizierten P.falciparum-Infektionen mit entweder AS oder DHA-PPQ zu bewerten. Symptomatische Patienten mit P.falciparum-Monoinfektionen, die die Studienkriterien erfüllen, werden in die Studie aufgenommen, einem der Behandlungsarme randomisiert und 42 Tage lang nachbeobachtet. Alle Medikamentenverabreichungen werden direkt überwacht und die Patienten werden gemäß einem erweiterten WHO-Protokoll 42 Tage lang aktiv nachbeobachtet. Am Ende der Nachbeobachtungszeit werden alle Patienten, die Träger von Gametozyten sind, gemäß den nationalen Richtlinien mit einer Einzeldosis Primaquine (0,75 mg/kg) behandelt.

3.2. Studienstandort und Population Die Studie wird im Distrikt Krong Pa in der Provinz Gia Lai durchgeführt, wo sowohl P.falciparum- als auch P.vivax-Malaria-Inzidenzen landesweit am höchsten sind. Die Studie wird in der Gemeinde Chu R'Cam stattfinden, wo das Studienteam mit dem örtlichen Gesundheitspersonal und allen Gesundheitszentren der umliegenden Gemeinden mit Malariapatienten zusammenarbeiten wird.

Die lokale Bevölkerung besteht hauptsächlich aus der ethnischen Minderheit der Gia Rai, deren Hauptbeschäftigungen die Brandrodung (hauptsächlich Mais, Maniok und Reis) auf Waldfeldern sind, zusammen mit Saisonarbeit auf Kautschukplantagen und der kleinen Produktion von Waren für den täglichen Bedarf Lebensunterhalt oder Gewerbe z.B. Kaffee und Cashewnüsse. Das Klima ist tropisch mit einer Trockenzeit von November bis April und einer Regenzeit von Mai bis Oktober. Das Gebiet ist hügelig und bewaldet (Sekundärwald) und der Hauptüberträger von Malaria ist Anopheles dirus.

3.4. Studienpopulation Die Zielpopulation umfasst alle mit P. falciparum infizierten Patienten, die sich entweder spontan beim CHC vorstellen oder vom Gesundheitspersonal der umliegenden CHCs überwiesen werden.

3.5. Versuchsverfahren 3.5.1 Screening. Alle konsultierenden Patienten, die während des Screenings die grundlegenden Aufnahmekriterien erfüllen, erhalten eine fortlaufende Screening-Nummer und werden vom Arzt vertieft evaluiert. Sobald der Patient alle Einschlusskriterien erfüllt, wird er oder sie (oder ein Elternteil oder Erziehungsberechtigter bei Kindern) um Zustimmung zur Teilnahme an der Studie gebeten und ihm wird eine Studiennummer (ID = fortlaufende Nummerierung) zugewiesen. Jede Person, die sich entscheidet, nicht an der Studie teilzunehmen, wird vom Personal der Gesundheitseinrichtung gemäß dem vom Gesundheitsministerium festgelegten Versorgungsstandard untersucht, behandelt und nachbeobachtet.

3.5.2. Randomisierung und Behandlungszuteilung Die Randomisierung erfolgt in 10er-Blöcken mit einem Verteilungsverhältnis von 1:1.

Bei der Einschreibung wird der Patient befragt und körperlich untersucht und ein standardisierter vorcodierter Fragebogen wird ausgefüllt. Bei der Einschreibung wird allen Patienten eine venöse Blutprobe in sterilen Vacutainer-Röhrchen mit EDTA oder Säure-Citrat-Dextrose (EDTA/ACD) entnommen. Bei Erwachsenen werden mindestens 5 ml Blut – und höchstens 8 ml – und bei Kindern 1 ml/kg bis zu 5 ml entnommen. Zwei Bluttropfen werden in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 500 µl RNAprotect-Reagenz (Qiagen) gegeben.

3.5.3 Behandlung Alle Patienten erhalten 3 Tage lang eine vollständige Behandlung entweder nur mit AS (4 mg/kg/Tag) oder DHA-PPQ (Zieldosis DHA = 4 mg/kg/Tag), um die frühe Parasitenbeseitigung zu bewerten. Da eine 3-tägige AS-Behandlung zur Behandlung von P. falciparum nicht ausreicht, wird sie gemäß den Empfehlungen der WHO durch eine zusätzliche 3-tägige DHA-PPQ-Behandlung ergänzt. Die Patienten werden nach der Behandlung 60 Minuten lang auf Nebenwirkungen oder Erbrechen beobachtet. Patienten, die ihr Medikament innerhalb der ersten 30 Minuten erbrechen, erhalten eine wiederholte volle Dosis; diejenigen, die nach 30-60 Minuten erbrechen, erhalten die halbe Dosis.

Notfallmedikamente werden gemäß den nationalen Richtlinien verabreicht:

Orales Notfallmedikament: Chinin (30 mg/kg/Tag) und Clindamycin (15 mg/kg/Tag) für 7 Tage; Rettungsmedikament IV: Chinin (30 mg/kg/Tag) und Doxycyclin (3 mg/kg/Tag) für 7 Tage 3.5.4. Nachsorge Von Tag 0 bis Parasitenbeseitigung: Nachdem die erste Dosis des Antimalariamedikaments verabreicht und eine Stunde lang beobachtet wurde, werden die Patienten mindestens bis Tag 3 alle 12 Stunden blutmikroskopisch überwacht und länger, falls erforderlich, bis zur als zwei definierten Parasitenbeseitigung aufeinanderfolgende negative Dias. Bei jedem Besuch wird der Patient befragt und körperlich untersucht, das Nachsorgeformular ausgefüllt und alle unerwünschten Ereignisse dokumentiert. Für die folgenden Ergebnisse wird eine Fingerstich-Blutprobe entnommen: zwei Blutschnitte zur LM-Beobachtung (Dick- und Dünnfilm), 200 µl Blut in ein EDTA/ACD-Microtainer-Röhrchen für die spätere DNA-Extraktion und 2 Tropfen Blut in einen anderen Microtainer Röhrchen mit RNAprotect für die spätere RNA-Extraktion. An Tag 3 wird ein zusätzlicher Blutstropfen entnommen, um die Hb-Konzentration zu messen.

Tag 7, 14, 21, 28, 35, 42 Die Patienten werden dann gebeten, die Klinik zu besuchen (oder zu Hause besucht zu werden) für jeden Nachsorgebesuch, während dessen sie befragt und untersucht werden, das Nachsorgeformular wird erstellt abgeschlossen und alle unerwünschten Ereignisse dokumentiert werden. Für die folgenden Ergebnisse wird eine Blutprobe aus dem Finger entnommen: zwei Blutschnitte zur LM-Beobachtung (Dick- und Dünnfilm), 200 μl Blut in einem EDTA/ACD-Microtainer-Röhrchen zur DNA-Extraktion und 2 Tropfen Blut in einem RNAprotect-haltigen Microtainer-Röhrchen . An den Tagen 7, 14, 28 und 42 wird ein Blutstropfen zur Bestimmung der Hb-Konzentration (Hemocue) entnommen.

Tag des P. falciparum-Rezidivs Rezidiv ist definiert als jede P. falciparum-Parasitämie, die durch LM-Untersuchung während der Nachbeobachtungszeit des Patienten und nach anfänglicher Parasitenbeseitigung festgestellt wird. Wenn ein erneutes Auftreten bestätigt wird, wird vor der Verabreichung der Notfallbehandlung eine weitere venöse Blutprobe entnommen (mindestens 5 ml/maximal 8 ml): Ex-vivo-Assays werden mit einem Teil des Blutes durchgeführt, während der Rest für zukünftige Untersuchungen zur Arzneimittelresistenz kryokonserviert wird Mechanismen.

3.5.5. Nachsorgeverlust und Protokollverstöße Ein Nachsorgeverlust tritt ein, wenn ein eingeschriebener Patient trotz aller angemessenen Bemühungen nicht an den geplanten Besuchen teilnimmt und nicht gefunden werden kann. Diesen Patienten wird kein Behandlungsergebnis zugeordnet. Diese Patienten werden als „lost to follow-up“ klassifiziert und zensiert oder von der Analyse ausgeschlossen. Studienpatienten, die eines der folgenden Kriterien erfüllen, werden als zurückgezogen eingestuft: i) Widerruf der Einwilligung; ii) Nichtbeendigung der Behandlung; iii) Registrierungsverletzung; iv) freiwilliger Protokollverstoß; v) unfreiwillige Verletzung des Protokolls.

3.5.6 Laborverfahren und Auswertung Mikroskopie: Beim Screening sollten drei Objektträger (dünne & dicke und dünne Filme) erhalten werden. Ein Objektträger wird für das anfängliche Screening schnell gefärbt (10 % Giemsa für 15 Minuten). Sobald der Patient aufgenommen ist, werden die anderen beiden Objektträger sorgfältiger gefärbt (3 % Giemsa für 45 Minuten). Die Parasitendichte wird bestimmt, indem die Anzahl der asexuellen Parasiten pro 200 weißen Blutkörperchen (WBCs) mit einem Handzähler gezählt wird. Wenn mehr als 500 Parasiten gezählt wurden, bevor 200 Leukozyten erreicht wurden, wird die Zählung nach Beendigung des Feldes gestoppt. Die Dichte, die als Anzahl asexueller Parasiten pro ul Blut ausgedrückt wird, wird berechnet, indem die Anzahl asexueller Parasiten durch die Anzahl gezählter weißer Blutkörperchen dividiert und um die geschätzte Leukozytendichte (typischerweise 8000 pro ul) korrigiert wird. Wenn die Anzahl der asexuellen Parasiten weniger als 10 pro 200 weiße Blutkörperchen in Folgeabstrichen beträgt, wird gegen mindestens 500 weiße Blutkörperchen gezählt. Ein Blutbild gilt als negativ, wenn die Untersuchung von 1000 weißen Blutkörperchen keine asexuellen Parasiten zeigt. Die Gametozytendichte wird berechnet, indem die Anzahl der Gametozyten pro 500 WBCs gezählt wird.

Die Hämoglobin (Hb)-Konzentration wird anhand von Vollblut gemessen, das in einer Mikroküvette unter Verwendung von Hemocue gemäß den Anweisungen des Herstellers entnommen wird.

Molekularer Nachweis von P. falciparum: DNA wird aus Blutproben entnommen, die in den Finger gestochen werden und in Microtainern gesammelt werden. Die molekulare Bestätigung von Plasmodium-Spezies (P.vivax, P.falciparum, P.ovale und P.malariae) an Tag 0 wird durch qPCR durchgeführt, die auf das ribosomale 18S-Gen abzielt. Dieselbe qPCR-Methode wird zur Identifizierung und Quantifizierung von Infektionen mit P. falciparum an Tag 0 und zur Nachverfolgung von Proben verwendet.

Genotypisierung von P. falciparum für Wiederauftreten/neue Infektion: Die Genotypisierung der wiederkehrenden Infektionen erfolgt durch Charakterisierung von MSP1, MSP2 und GLURP, Single-Copy-Genen im Genom von Plasmodium falciparum, wie an anderer Stelle beschrieben.

RNA-Extraktion und RT-qPCR für Gametozyten: RNA wird aus RNAprotect-Proben unter Verwendung von Affinitätssäulen und DNAse-Verdau von genomischer DNA extrahiert. Um P. falciparum-Gametozytenstadien nachzuweisen und zu quantifizieren, wird am Tag 0 und in allen Folgeproben eine reverse Transkriptions-qPCR (RT-qPCR) durchgeführt, die auf Pfs25-Gentranskripte abzielt, gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen mit Modifikationen.

Ex-vivo-Arzneimittelsensitivitätstests: In EDTA/ACD-Röhrchen entnommenes venöses Blut (am Tag 0 und am Tag des Rezidivs) wird innerhalb von 6 Stunden nach der Entnahme verarbeitet. Blut wird zentrifugiert und Plasma und Buffy Coat entfernt und bei -20 °C gelagert. Rote Blutkörperchen werden zweimal in RPMI gewaschen und in Kulturmedium (RPMI 1640 LPLF-Flüssigmedium) zu einer 50%igen Hämatokrit-Blutmediummischung (BMM) resuspendiert.

Standard-Ex-vivo-Arzneimittelsensitivitätsassay: Die Bewertung folgt den WHO-Richtlinien „Field application of in vitro assay for the sensitive of human malaria parasits to antimalaria drugs“ für die Bewertung der Reaktion von P. falciparum auf Artemisinine“.

Ex-vivo-Ringstadium-Überlebensassays (RSA) Zusätzlich zu standardmäßigen Ex-vivo-Assays wird die Leistung von Ringstadium-Überlebensassays (RSA) nach einem veröffentlichten Protokoll untersucht.

Molekulare Marker der Artemisinin-Resistenz: Extrahierte DNA wird verwendet, um Punktmutationen in der Kelch-Propeller-Domäne von P. falciparum (K13) zu genotypisieren, die kürzlich als Kandidaten für molekulare Resistenzmarker für Artemisinin-Resistenz identifiziert wurden. Kurz gesagt, K13 wird in einer verschachtelten PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die im WWARN-Verfahren INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures] beschrieben sind. Nach Bestätigung durch Agarose-Gelelektrophorese werden die Produkte sequenziert und analysiert, um Polymorphismen zu identifizieren. Alternative potenzielle Kandidaten für eine Artemisinin-Resistenz können ebenfalls untersucht werden. 4. QUALITÄTSSICHERUNG Überwachungsbesuche vor Ort werden regelmäßig geplant. Während dieser Besuche werden die in den Fallberichtsformularen (CRFs) aufgezeichneten Informationen mit Quelldokumenten (z. B. Laboraufzeichnungen und Klinikregistern) verglichen. Nachdem die CRF-Formulare am Ende der Studie zusammengestellt wurden, werden sie auf Vollständigkeit und Richtigkeit überprüft. Die Daten werden vor Ort doppelt in eine elektronische Datenbank (Epi Info) eingegeben, wo speziell entwickelte Computerprüfungen verwendet werden, um Abweichungen bei der Dateneingabe, ungültige Datenbereiche und Gesamtkonsistenz zu identifizieren. Alle Abweichungen werden unter Bezugnahme auf die geprüften Originaldatenerhebungsformulare geklärt.

Alle Blutausstriche bei der Aufnahme werden am Studienort sowie von einem erfahrenen Mikroskopiker in einem koordinierenden Zentrum gelesen. Zusätzlich wird bei 10 % der zufällig ausgewählten Objektträger eine externe Qualitätskontrolle am ITM durchgeführt. Für jeden der molekularen Assays (qPCR, RT-qPCR und Parasiten-Genotypisierung) werden 10 % der bei NIMPE verarbeiteten Proben nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, um bei ITM erneut analysiert zu werden. Eine externe Qualitätskontrolle der Ergebnisse von Ex-vivo-Arzneimitteltests wird am ITM durchgeführt, wo die Objektträger erneut auf 10 % der zufällig ausgewählten Isolate untersucht werden.

5. Statistischer Analyseplan Die Parasiten-Clearance-Zeit ist definiert als die verstrichene Zeit (in Stunden) von der Behandlungszeit des Patienten (erste Dosis) bis zum ersten von zwei aufeinanderfolgenden negativen Blutschnitten. Parasitenbeseitigungszeit und -rate sowie Verzögerungsphase werden mit dem von WWARN entwickelten PCE-Online-Tool angepasst. Die Analyse der 42-Tage-Heilungsrate wird sowohl für die modifizierte Intention-to-Treat (mITT)-Patientenpopulation (alle randomisierten Patienten) als auch für die auswertbare Patientenpopulation (Per Protocol) durchgeführt. Patienten sind für die Analyse der 28/42-Tage-Heilungsrate auswertbar, wenn bis zum 26./40. Tag Parasitenzahlen erhoben werden oder der Patient die Behandlung wegen „unbefriedigender therapeutischer Wirkung“ wegen Wiederauftretens von Parasiten abbricht. Die mITT-Analyse schließt auch Patienten ein, die vor Tag 28/42 aus anderen Gründen als „unbefriedigende therapeutische Wirkung“ abbrechen (z. B. könnte dies „unerwünschte Erfahrung(en)“ aufgrund wiederholten Erbrechens umfassen). Diese Patienten werden in der mITT-Analyse unabhängig von ihrem Abbruchgrund als Behandlungsversagen gezählt. Patienten, die gleichzeitig mit Antibiotika behandelt wurden, die eine Anti-Malaria-Wirkung haben, werden von den auswertbaren Patienten ausgeschlossen und in die mITT aufgenommen.

Für kategoriale Variablen werden Prozentsätze und entsprechende 95 %-Konfidenzintervalle nach der Methode von Wilson berechnet. Die Anteile werden verglichen, indem *2 mit der Yates-Korrektur oder gegebenenfalls mit dem exakten Test von Fisher berechnet wird. Normalverteilte kontinuierliche Daten werden als Mittelwerte und Standardabweichungen zusammengefasst und mit Student's t-Test und Varianzanalyse verglichen. Daten, die keiner Normalverteilung entsprechen, werden als Mediane (IQR) oder geometrische Mittelwerte zusammengefasst und mit dem Mann-Whitney-U-Test oder der Kruskal-Wallis-Varianzanalyse verglichen. Die Assoziation zwischen zwei kontinuierlichen Variablen wird anhand des Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman bewertet.

Das Risiko eines Behandlungsversagens an Tag 28 und 42 wird allesamt durch Überlebensanalyse mit kumulativen Inzidenzen bewertet, die nach der Kaplan-Meier-Methode berechnet und mit dem Mantel-Haenszel-Log-Rank-Test verglichen werden.

Parasiten-, Fieber- und Gametozyten-Clearance-Zeiten werden ebenfalls nach der Kaplan-Meier-Methode bewertet.

Hämatologische Veränderungen während der ersten Behandlungswoche sowie die Erholung während der wöchentlichen Nachsorge werden durch Messung der Veränderungen der Hb-Konzentration zwischen Tag 0, 3, 7 und Tag 14, 28 bzw. 42 bewertet.

6. ETHISCHE FRAGEN Ethische Genehmigungen Die ethische Genehmigung zur Durchführung der Studie wurde von der Ethikkommission des Nationalen Instituts für Malariologie, Parasitologie und Entomologie, Hanoi und der Universität Antwerpen sowie vom Institutional Review Board des ITM eingeholt , Antwerpen.

Einverständniserklärung Patienten werden nur dann in die Studie aufgenommen, wenn sie (oder Eltern oder Erziehungsberechtigte von Kindern) ihr Einverständnis nach Aufklärung geben. Der Einwilligungsantrag ist in englischer Sprache verfügbar und wird in vietnamesische Sprache übersetzt und dem Patienten, Elternteil oder Erziehungsberechtigten vollständig vorgelesen. Einzelheiten über die Studie und ihre Vorteile und potenziellen Risiken werden erläutert. Sobald alle Fragen beantwortet sind, wird eine Unterschrift auf dem Dokument angefordert. Wenn der Patient Analphabet ist, muss ein schriftkundiger Zeuge unterschreiben; wenn möglich, wird der Unterzeichner vom Teilnehmer ausgewählt und hat keine Verbindung zum Forschungsteam.