P. Falciparum Resistance to Artemisinin Vietnamissa

3.1 Tutkimuksen suunnittelu Tämä tutkimus on suunniteltu satunnaistetuksi avoimeksi 42 päivän seurantatutkimukseksi kliinisen ja parasitologisen vasteen arvioimiseksi komplisoitumattomien P. falciparum -infektioiden hoidon jälkeen joko AS:lla tai DHA-PPQ:lla. Oireiset potilaat, joilla on P.falciparum-monoinfektio ja jotka täyttävät tutkimuksen kriteerit, otetaan mukaan tutkimukseen, satunnaistetaan johonkin hoitohaaroista ja niitä seurataan 42 päivän ajan. Kaikkia lääkkeiden antamista tarkkaillaan suoraan ja potilaita seurataan aktiivisesti 42 päivän ajan WHO:n laajennetun protokollan mukaisesti. Seurantaajan lopussa kaikkia gametosyyttejä kantavia potilaita hoidetaan kerta-annoksella Primaquinea (0,75 mg/kg) kansallisten ohjeiden mukaisesti.

3.2. Tutkimuspaikka ja väestö Tutkimus suoritetaan Krong Pa -alueella, Gia Lain maakunnassa, jossa sekä P.falciparum- että P.vivax-malariaesiintyvyys on maan korkein. Tutkimus sijoitetaan Chu R'Camin kunnassa, jossa tutkimusryhmä työskentelee yhdessä paikallisen terveydenhuollon henkilökunnan ja kaikkien ympäröivien kuntien malariapotilaiden terveyskeskusten kanssa.

Paikallinen väestö koostuu pääosin gia rai -etnisestä vähemmistöstä, jonka pääammatit koostuvat slash and polttaa maanviljelystä (pääasiassa maissi, maniokki ja riisi) metsäpelloilla sekä kausityö kumiviljelmillä ja pientuotanto päivittäiseen käyttöön. toimeentulo tai kauppa esim. kahvia ja cashewpähkinöitä. Ilmasto on trooppinen ja kuiva kausi kestää marraskuusta huhtikuuhun ja sadekausi toukokuusta lokakuuhun. Alue on mäkinen ja metsäinen (toissijainen metsä) ja pääasiallinen malarian levittäjä on Anopheles dirus.

3.4. Koepopulaatio Kohdepopulaatio sisältää kaikki P. falciparum -tartunnan saaneet potilaat, jotka joko saapuvat spontaanisti CHC:hen tai jotka ympäröivän CHC:n terveydenhuoltohenkilöstö lähettää.

3.5. Koemenettelyt 3.5.1 Seulonta. Kaikille seulonnan aikana perusilmoittautumiskriteerit täyttäville konsultoiville potilaille annetaan peräkkäinen seulontanumero ja lääkäri arvioi ne perusteellisemmin. Kun potilas täyttää kaikki ilmoittautumiskriteerit, häneltä (tai lapsen vanhemmalta tai huoltajalta) pyydetään suostumus tutkimukseen osallistumiseen ja hänelle annetaan tutkimusnumero (ID = järjestysnumerointi). Henkilö, joka päättää olla osallistumatta tutkimukseen, tulee terveyskeskuksen henkilökunnan tarkastukseen, hoitoon ja seurantaan terveysministeriön asettaman hoitostandardin mukaisesti.

3.5.2. Satunnaistaminen ja hoidon kohdentaminen Satunnaistaminen suoritetaan 10:n lohkoissa allokaatiosuhteella 1:1.

Ilmoittautumisen yhteydessä potilasta haastatellaan ja tutkitaan fyysisesti ja täytetään standardoitu esikoodattu kyselylomake. Laskimoverinäytteet kerätään kaikilta ilmoittautuneilta potilailta steriileihin vacutainer-putkiin, jotka sisältävät EDTA:ta tai happo-sitraatti-dekstroosia (EDTA/ACD). Aikuisilta kerätään vähintään 5 ml ja enintään 8 ml verta ja lapsilta 1 ml/kg enintään 5 ml. Kaksi veritippaa lisätään 1,5 ml:n putkeen, joka sisältää 500 µl RNAprotect-reagenssia (Qiagen).

3.5.3 Hoito Kaikki potilaat saavat täyden hoidon joko pelkällä AS:lla (4 mg/kg/vrk) tai DHA-PPQ:lla (tavoiteannos DHA = 4 mg/kg/vrk) kolmen päivän ajan varhaisen loisen puhdistuman arvioimiseksi. Koska 3 päivän AS-hoito ei riitä P. falciparumin hoitoon, se täydentyy 3 päivän DHA-PPQ-lisähoito-ohjelmalla WHO:n suositusten mukaisesti. Potilaita tarkkaillaan 60 minuutin ajan hoidon jälkeen haittavaikutusten tai oksentelun varalta. Potilaat, jotka oksentavat lääkityksensä ensimmäisten 30 minuutin aikana, saavat toistuvan täyden annoksen; ne, jotka oksentavat 30-60 minuuttia, saavat puolet annoksesta.

Pelastuslääkkeitä annetaan kansallisten ohjeiden mukaisesti:

Pelastuslääke suun kautta: kiniini (30 mg/kg/vrk) ja klindamysiini (15 mg/kg/vrk) 7 päivän ajan; IV pelastuslääke: kiniini (30 mg/kg/vrk) ja doksisykliini (3 mg/kg/vrk) 7 päivän ajan 3.5.4. Seuranta päivästä 0 loisten puhdistumiseen asti: sen jälkeen, kun ensimmäinen malarialääkkeen annos on annettu ja tarkkailtu tunnin ajan, potilaita seurataan verimikroskoopilla 12 tunnin välein vähintään päivään 3 ja tarvittaessa kauemmin, kunnes loisen puhdistuma määritellään kahdeksi peräkkäiset negatiiviset diat. Jokaisella käynnillä potilasta haastatellaan ja tutkitaan fyysisesti, seurantalomake täytetään ja mahdolliset haittatapahtumat dokumentoidaan. Sormenpistoverinäyte otetaan seuraavia tuloksia varten: kaksi verilevyä LM-havainnointia varten (paksu ja ohut kalvo), 200 µl verta EDTA/ACD-mikrotainer-putkeen myöhempää DNA-uutosta varten ja 2 tippaa verta toiseen mikrotaineriin. putkessa, joka sisältää RNAprotectin myöhempää RNA:n uuttamista varten. Ylimääräinen pisara verta otetaan päivänä 3 Hb-pitoisuuden mittaamiseksi.

Päivät 7, 14, 21, 28, 35, 42 Potilaita pyydetään sitten saapumaan klinikalle (tai vierailemaan kotona) jokaiselle seurantakäynnille, jonka aikana heitä haastatellaan ja tutkitaan. täytettävä ja kaikki haittatapahtumat dokumentoidaan. Sormenpistoverinäyte kerätään seuraavia tuloksia varten: kaksi verilevyä LM-havainnointia varten (paksu ja ohut kalvo), 200 μl verta EDTA/ACD-mikrotainer-putkessa DNA:n erottamista varten ja 2 tippaa verta RNAprotectin sisältävässä mikrotainerputkessa . Päivänä 7, 14, 28 ja 42 otetaan yksi tippa verta Hb-pitoisuuden määrittämiseksi (Hemocue).

P. falciparumin uusiutumisen päivä Uusiutuminen määritellään mitä tahansa P. falciparum-parasitemiaa, joka havaitaan LM-tutkimuksella potilaan seurantajakson aikana ja alkuperäisen loisen puhdistuksen jälkeen. Jos uusiutuminen varmistetaan, otetaan uusi laskimoverinäyte (vähintään 5 ml/enintään 8 ml) ennen pelastushoidon antamista: ex vivo -määritykset tehdään yhdellä osalla verta ja loput kylmäsäilytetään tulevia lääkeresistenssitutkimuksia varten. mekanismeja.

3.5.5. Tappio seuranta- ja protokollarikkomuksissa Seurannan menetys tapahtuu, kun kaikista kohtuullisista ponnisteluista huolimatta potilas ei tule paikalle sovituille käynneille eikä häntä löydy. Näille potilaille ei määrätä hoitotulosta. Nämä potilaat luokitellaan seurannan vuoksi kadonneiksi ja sensuroidaan tai suljetaan pois analyysistä. Tutkimuspotilaat, jotka täyttävät jonkin seuraavista kriteereistä, luokitellaan peruutetuiksi: i) suostumuksen peruuttaminen; ii) hoidon epäonnistuminen; iii) ilmoittautumisrikkomus; iv) vapaaehtoinen protokollarikkomus; v) tahaton protokollarikkomus.

3.5.6 Laboratoriotoimenpiteet ja arviointi Mikroskooppi: kolme objektilasia (ohut & paksut ja ohut kalvot) tulee saada seulonnan yhteydessä. Yksi objektilasi värjätään nopeasti (10 % Giemsa 15 minuutin ajan) alkuseulontaa varten. Kun potilas on otettu mukaan, kaksi muuta objektilasia värjätään huolellisemmin (3 % Giemsa 45 minuutin ajan). Loisten tiheys määritetään laskemalla aseksuaalisten loisten määrä 200 valkosolua (WBC) kohti käsilaskurin avulla. Jos yli 500 loista on laskettu ennen kuin 200 WBC:tä on saavutettu, laskenta keskeytetään kentän suorittamisen jälkeen. Tiheys, joka ilmaistaan ​​aseksuaalisten loisten lukumääränä per µl verta, lasketaan jakamalla aseksuaalisten loisten lukumäärä laskettujen valkosolujen lukumäärällä ja korjattu arvioidulla valkosolujen tiheydellä (tyypillisesti 8000 per µl). Kun aseksuaalisten loisten määrä on alle 10 per 200 valkosolua seurantatutkimuksessa, lasketaan vähintään 500 valkosolua. Veriliuskaa pidetään negatiivisena, jos 1000 valkosolun tutkiminen ei paljasta suvuttomia loisia. Gametosyyttien tiheys lasketaan laskemalla gametosyyttien määrä 500 valkosolua kohti.

Hemoglobiini (Hb) -pitoisuus mitataan kokoverestä, joka on kerätty mikrokyvettiin käyttämällä Hemocuea valmistajan ohjeiden mukaisesti.

P. falciparum -molekyylien havaitseminen: DNA uutetaan mikrotainereihin kerätyistä sormenpistoverinäytteistä. Plasmodium-lajien (P.vivax, P.falciparum, P.ovale ja P.malariae) molekyylivahvistus päivänä 0 suoritetaan qPCR:llä, joka kohdistuu 18S-ribosomaaliseen geeniin. Samaa qPCR-menetelmää käytetään P. falciparum -infektioiden tunnistamiseen ja kvantifiointiin päivänä 0 ja näytteiden seurantaan.

P. falciparumin genotyypitys uusiutumiseen/uudelle infektiolle: toistuvien infektioiden genotyypitys tehdään karakterisoimalla MSP1-, MSP2- ja GLURP-geenit, Plasmodium falciparum -genomin yhden kopion geenit, kuten muualla on kuvattu.

RNA:n uutto ja RT-qPCR gametosyyteille: RNA uutetaan RNAprotect-näytteistä käyttämällä affiniteettipylväitä ja genomisen DNA:n DNAase-digestiota. P. falciparumin gametosyyttivaiheiden havaitsemiseksi ja kvantifioimiseksi Pfs25-geenin transkripteihin kohdistuva käänteistranskriptio-qPCR (RT-qPCR) tehdään päivänä 0 ja kaikissa seurantanäytteissä noudattaen aiemmin kuvattuja protokollia modifikaatioineen.

Ex vivo lääkeherkkyysmääritykset: EDTA/ACD-putkiin kerätty laskimoveri (päivänä 0 ja uusiutumispäivänä) käsitellään 6 tunnin kuluessa keräämisestä. Veri sentrifugoidaan ja plasma ja buffy coat poistetaan ja säilytetään -20 ºC:ssa. Punaiset verisolut pestään kahdesti RPMI:ssä ja suspendoidaan uudelleen elatusaineeseen (RPMI 1640 LPLF nestemäinen väliaine) 50 % hematokriittiseen veriväliaineseokseen (BMM).

Standardi ex vivo -lääkeherkkyysmääritys: Arvioinnissa noudatetaan WHO:n ohjeita "Ihmisen malarialoisten herkkyyttä malarialääkkeille koskevan in vitro -määrityksen kenttäsovellus arvioitaessa P. falciparumin vastetta artemisiiniineille".

Ex vivo -rengasvaiheen eloonjäämismääritykset (RSA) Tavallisten ex vivo -määritysten lisäksi tutkitaan rengasvaiheen eloonjäämismääritysten (RSA) suorituskykyä julkaistun protokollan mukaisesti.

Artemisiniiniresistenssin molekyylimarkkerit: uutettua DNA:ta käytetään P. falciparumin Kelchin potkuridomeenin (K13) pistemutaatioiden genotyyppiin, jotka on äskettäin tunnistettu artemisiniiniresistenssin molekyylimarkkereiksi. Lyhyesti sanottuna K13 monistetaan sisäkkäisessä PCR:ssä käyttämällä alukkeita, jotka on kuvattu WWARN-menettelyssä INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Agaroosigeelielektroforeesin vahvistuksen jälkeen tuotteet sekvensoidaan ja analysoidaan polymorfismien tunnistamiseksi. Vaihtoehtoisia tulevia artemisiniiniresistenssin ehdokkaita voidaan myös tutkia. 4. LAADUNVARMISTUS Paikalle järjestetään seurantakäyntejä säännöllisesti. Näiden käyntien aikana tapausraporttilomakkeille (CRF) tallennetut tiedot verrataan lähdeasiakirjoihin (esim. laboratorioasiakirjat ja klinikan rekisterit). Kun CRF-lomakkeet on koottu kokeilun lopussa, niiden täydellisyys ja tarkkuus tarkistetaan. Tiedot syötetään paikan päällä kahteen kertaan sähköiseen tietokantaan (Epi Info), jossa käytetään erityisesti suunniteltuja tietokonetarkistuksia tietojen syöttämisen eroavaisuuksien, virheellisten tietoalueiden ja yleisen johdonmukaisuuden tunnistamiseksi. Kaikki ristiriidat ratkaistaan ​​viittaamalla alkuperäisiin tarkistettuihin tiedonkeruulomakkeisiin.

Kaikki sisäänpääsyn yhteydessä olevat verifilmit luetaan tutkimuspaikalla sekä vanhempi mikroskooppi koordinointikeskuksessa. Lisäksi ITM:ssä tehdään ulkoinen laadunvalvonta 10 %:lle satunnaisesti valituista dioista. Jokaisessa molekyylimäärityksessä (qPCR, RT-qPCR ja loisten genotyypitys) 10 % NIMPE:ssä käsitellyistä näytteistä valitaan satunnaisesti analysoitaviksi uudelleen ITM:ssä. Ex vivo -lääkemäärityksen tulosten ulkoinen laadunvalvonta tehdään ITM:ssä, jossa objektilaseista tutkitaan uudelleen 10 % satunnaisesti valituista isolaateista.

5. Tilastollinen analyysisuunnitelma Loisen poistumisaika määritellään ajalle, joka on kulunut (tunteina) potilaan hoitokerrasta (ensimmäinen annos) ensimmäiseen kahdesta peräkkäisestä negatiivisesta verilasista. Loisten poistumisaika ja -nopeus sekä viivevaihe sovitetaan WWARNin kehittämän PCE-verkkotyökalun avulla. 42 päivän paranemisasteen analyysi suoritetaan sekä modifioidulle hoitotarkoitukselle (mITT) potilaspopulaatiolle (kaikki satunnaistetut potilaat) että arvioitavalle potilaspopulaatiolle (protokollaa kohti). Potilaat ovat arvioitavissa 28/42 vuorokauden paranemisasteen analysoinnissa, jos loisten määrä kirjataan päivään 26/40 asti tai potilas lopettaa hoidon "epätyydyttävän terapeuttisen vaikutuksen" vuoksi loisten uudelleen ilmaantumisen vuoksi. mITT-analyysi sisältää myös potilaat, jotka lopettavat hoidon ennen päivää 28/42 muista syistä kuin "epätyydyttävän terapeuttisen vaikutuksen" vuoksi (esimerkiksi tämä voi sisältää "haitalliset kokemukset" toistuvan oksentelun vuoksi). Nämä potilaat lasketaan mITT-analyysissä hoidon epäonnistuneiksi riippumatta heidän keskeytyksensä syystä. Potilaat, jotka ovat saaneet samanaikaista hoitoa antibiooteilla, joilla on malariaa estävä vaikutus, suljetaan pois arvioitavista potilaista ja sisällytetään mITT:hen.

Kategoristen muuttujien prosenttiosuudet ja vastaavat 95 %:n luottamusvälit lasketaan Wilsonin menetelmällä. Suhteita verrataan laskemalla *2 Yatesin korjauksella tai tarvittaessa Fisherin tarkalla testillä. Normaalisti jakautuneet jatkuvat tiedot kootaan keskiarvoiksi ja keskihajotuksiksi, ja niitä verrataan Studentin t-testillä ja varianssianalyysillä. Tiedot, jotka eivät ole normaalijakauman mukaisia, kootaan mediaaniksi (IQR) tai geometrisiksi keskiarvoiksi ja niitä verrataan Mann-Whitney U -testillä tai Kruskal-Wallis -varianssianalyysillä. Kahden jatkuvan muuttujan välinen yhteys arvioidaan käyttämällä Spearmanin rankkorrelaatiokerrointa.

Hoidon epäonnistumisen riski päiviin 28 ja 42 mennessä arvioidaan kaikki eloonjäämisanalyysillä kumulatiivisilla ilmaantuvuuksilla, jotka lasketaan Kaplan Meierin menetelmällä ja verrataan Mantel-Haenszelin log rank -testillä.

Myös loisten, kuumeen ja gametosyyttien poistumisajat arvioidaan Kaplan Meier -menetelmällä.

Hematologiset muutokset ensimmäisen hoitoviikon aikana sekä toipuminen viikoittaisen seurannan aikana arvioidaan mittaamalla Hb-pitoisuuden muutokset päivien 0, 3, 7 ja päivän 14, 28 ja 42 välillä.

6. EETTISET KYSYMYKSET Eettiset luvat Eettiset hyväksynnät tutkimuksen suorittamiseksi on hankittu Hanoin kansallisen malariologian, parasitologian ja entomologian instituutin eettiseltä komitealta ja Antwerpenin yliopistolta sekä ITM:n instituutioiden arviointilautakunnalta. , Antwerpen.

Tietoinen suostumus Potilaat otetaan mukaan tutkimukseen vain, jos he (tai lasten vanhemmat tai huoltajat) antavat tietoisen suostumuksen. Suostumuspyyntö on saatavilla englanniksi ja käännetty vietnam kielelle luetaan kokonaan potilaalle, vanhemmalle tai huoltajalle. Yksityiskohdat kokeesta ja sen eduista ja mahdollisista riskeistä selitetään. Kun kaikkiin kysymyksiin on vastattu, asiakirjaan pyydetään allekirjoitusta. Jos potilas on lukutaidoton, lukutaitoisen todistajan on allekirjoitettava; mikäli mahdollista, osallistuja valitsee allekirjoittajan, eikä hänellä ole mitään yhteyttä tutkimusryhmään.