P. Falciparum Resistenza all'artemisinina in Vietnam

3.1 Disegno dello studio Questo studio è concepito come uno studio randomizzato in aperto di follow-up di 42 giorni per valutare le risposte cliniche e parassitologiche dopo il trattamento di infezioni non complicate da P.falciparum con AS o DHA-PPQ. I pazienti sintomatici con mono-infezioni da P.falciparum, che soddisfano i criteri dello studio, saranno arruolati nello studio, randomizzati a uno dei bracci di trattamento e seguiti per 42 giorni. Tutta la somministrazione del farmaco sarà osservata direttamente e i pazienti saranno seguiti attivamente per 42 giorni secondo un protocollo esteso dell'OMS. Al termine del periodo di follow-up, tutti i pazienti portatori di gametociti saranno trattati con una singola dose di Primachina (0,75 mg/kg) seguendo le linee guida nazionali.

3.2. Sede e popolazione dello studio Lo studio sarà condotto nel distretto di Krong Pa, provincia di Gia Lai, dove le incidenze di malaria sia da P.falciparum che da P.vivax sono le più alte del paese. Lo studio sarà situato nel comune di Chu R'Cam, dove il team dello studio lavorerà insieme al personale sanitario locale e a tutti i centri sanitari dei comuni circostanti con pazienti affetti da malaria.

La popolazione locale è composta principalmente dalla minoranza etnica Gia Rai le cui occupazioni principali consistono nell'agricoltura taglia e brucia (principalmente mais, manioca e riso) nei campi forestali, insieme al lavoro stagionale nelle piantagioni di gomma e alla produzione su piccola scala di beni per la sussistenza o commercio, ad es. caffè e anacardi. Il clima è tropicale con una stagione secca da novembre ad aprile e la stagione delle piogge da maggio a ottobre. L'area è collinare e boscosa (foresta secondaria) e il principale vettore della malaria è Anopheles dirus.

3.4. Popolazione dello studio La popolazione target comprende tutti i pazienti infetti da P. falciparum che si sono presentati spontaneamente al CHC o che sono stati indirizzati dal personale sanitario dei CHC circostanti.

3.5. Procedure di prova 3.5.1 Screening. A tutti i pazienti consultati che soddisfano i criteri di iscrizione di base durante lo screening verrà assegnato un numero progressivo di screening e valutati in modo più approfondito dal medico. Una volta che il paziente soddisfa tutti i criteri di iscrizione, a lui o lei (o un genitore o tutore in caso di bambini) verrà chiesto il consenso a partecipare allo studio e gli verrà assegnato un numero di studio (ID = numerazione sequenziale). Qualsiasi persona che decide di non partecipare allo studio sarà esaminata, curata e seguita dal personale della struttura sanitaria secondo lo standard di cura stabilito dal Ministero della Salute.

3.5.2. Randomizzazione e assegnazione del trattamento La randomizzazione sarà effettuata in blocchi di 10 con un rapporto di assegnazione di 1:1.

Al momento dell'arruolamento, il paziente verrà intervistato ed esaminato fisicamente e verrà compilato un questionario precodificato standardizzato. Un campione di sangue venoso verrà raccolto in provette vacutainer sterili contenenti EDTA o acido-citrato-destrosio (EDTA/ACD) da tutti i pazienti al momento dell'arruolamento. Verranno raccolti un minimo di 5 ml di sangue - e un massimo di 8 ml - da adulti e da 1 ml/kg fino a 5 ml da bambini. Due gocce di sangue verranno aggiunte in una provetta da 1,5 ml contenente 500 µL di reagente RNAprotect (Qiagen).

3.5.3 Trattamento Tutti i pazienti riceveranno un trattamento completo con AS da solo (4 mg/kg/die) o DHA-PPQ (dose target DHA=4 mg/kg/die) per 3 giorni al fine di valutare l'eliminazione precoce del parassita. Poiché un ciclo di AS di 3 giorni non è sufficiente per trattare P.falciparum, sarà completato da un regime DHA-PPQ aggiuntivo di 3 giorni secondo le raccomandazioni dell'OMS. I pazienti saranno osservati per 60 minuti dopo il trattamento per reazioni avverse o vomito. Quei pazienti che vomitano il farmaco entro i primi 30 minuti riceveranno una dose completa ripetuta; quelli che vomitano da 30-60 minuti riceveranno metà dose.

I farmaci di soccorso verranno somministrati seguendo le linee guida nazionali:

Droga orale di salvataggio: chinino (30 mg/kg/die) e clindamicina (15 mg/kg/die) per 7 giorni; Farmaco di salvataggio IV: chinino (30 mg/kg/die) e doxiciclina (3 mg/kg/die) per 7 giorni 3.5.4. Follow-up Dal giorno 0 fino alla clearance del parassita: dopo che la prima dose di farmaco antimalaria è stata somministrata e osservata per un'ora, i pazienti saranno monitorati ogni 12 ore mediante microscopia del sangue almeno fino al giorno 3 e più a lungo se necessario fino alla clearance del parassita definita come due diapositive negative consecutive. Ad ogni visita, il paziente sarà intervistato ed esaminato fisicamente, il modulo di follow-up compilato e qualsiasi evento avverso documentato. Verrà raccolto un campione di sangue con puntura del dito per i seguenti risultati: due vetrini di sangue per l'osservazione LM (film spesso e sottile), 200 µl di sangue in una provetta con microtainer EDTA/ACD per la successiva estrazione del DNA e 2 gocce di sangue in un altro microtainer provetta contenente RNAprotect per la successiva estrazione dell'RNA. Un'ulteriore goccia di sangue verrà prelevata al giorno 3 per misurare la concentrazione di Hb.

Giorno 7, 14, 21, 28, 35, 42 Ai pazienti verrà quindi chiesto di recarsi in clinica (o essere visitati a casa) per ogni visita di follow-up, durante la quale saranno intervistati ed esaminati, il modulo di follow-up sarà essere compilato e qualsiasi evento avverso documentato. Verrà raccolto un campione di sangue con puntura del dito per i seguenti risultati: due vetrini di sangue per l'osservazione LM (film spesso e sottile), 200 μl di sangue in una provetta microtainer EDTA / ACD per l'estrazione del DNA e 2 gocce di sangue in provetta contenente microtainer RNAprotect . Ai giorni 7, 14, 28 e 42 verrà prelevata una goccia di sangue per la concentrazione di Hb (Hemocue).

Giorno della recidiva di P. falciparum La recidiva è definita come qualsiasi parassitemia di P. falciparum rilevata dall'esame del LM durante il periodo di follow-up del paziente e dopo l'eliminazione iniziale del parassita. Se la recidiva è confermata, verrà prelevato un ulteriore campione di sangue venoso (minimo 5 ml/massimo 8 ml) prima della somministrazione del trattamento di salvataggio: i test ex-vivo verranno eseguiti con una parte del sangue mentre il resto verrà criopreservato per future indagini sulla resistenza ai farmaci meccanismi.

3.5.5. Perdita al follow-up e violazioni del protocollo La perdita al follow-up si verifica quando, nonostante tutti gli sforzi ragionevoli, un paziente arruolato non si presenta alle visite programmate e non può essere trovato. Nessun esito del trattamento sarà assegnato a questi pazienti. Questi pazienti saranno classificati come persi al follow-up e censurati o esclusi dall'analisi. I pazienti dello studio che soddisfano uno dei seguenti criteri saranno classificati come ritirati: i) ritiro del consenso; ii) mancato completamento del trattamento; iii) violazione dell'iscrizione; iv) violazione volontaria del protocollo; v) violazione involontaria del protocollo.

3.5.6 Procedure di laboratorio e valutazione Microscopia: allo screening devono essere ottenuti tre vetrini (pellicola sottile, spessa e sottile). Un vetrino verrà colorato rapidamente (10% Giemsa per 15 minuti) per lo screening iniziale. Una volta arruolato il paziente, gli altri due vetrini verranno colorati con maggiore attenzione (3% Giemsa per 45 minuti). La densità del parassita sarà determinata contando il numero di parassiti asessuati per 200 globuli bianchi (WBC) con un contatore manuale. Se sono stati contati più di 500 parassiti prima di raggiungere i 200 globuli bianchi, il conteggio verrà interrotto dopo il completamento del campo. La densità, espressa come numero di parassiti asessuati per µl di sangue, sarà calcolata dividendo il numero di parassiti asessuali per il numero di GB contati e corretto per la densità stimata di GB (tipicamente 8000 per µl). Quando il numero di parassiti asessuati è inferiore a 10 per 200 globuli bianchi negli strisci di follow-up, il conteggio verrà eseguito su almeno 500 globuli bianchi. Un vetrino di sangue sarà considerato negativo quando l'esame di 1000 globuli bianchi non rivelerà parassiti asessuati. La densità dei gametociti sarà calcolata contando il numero di gametociti per 500 GB.

La concentrazione di emoglobina (Hb) sarà misurata su sangue intero raccolto in micro-cuvette utilizzando Hemocue seguendo le istruzioni del produttore.

Rilevamento molecolare di P. falciparum: il DNA sarà estratto da campioni di sangue prelevati con puntura del dito raccolti in microtainer. La conferma molecolare delle specie di Plasmodium (P.vivax, P.falciparum, P.ovale e P.malariae) al giorno 0 sarà effettuata mediante qPCR mirata al gene ribosomiale 18S. Lo stesso metodo qPCR verrà utilizzato per identificare e quantificare le infezioni da P. falciparum al giorno 0 e per i campioni di follow-up.

Genotipizzazione di P. falciparum per recrudescenza/nuova infezione: la genotipizzazione delle infezioni ricorrenti sarà effettuata caratterizzando MSP1, MSP2 e GLURP, geni a singola copia nel genoma del Plasmodium falciparum come descritto altrove.

Estrazione dell'RNA e RT-qPCR per gametociti: L'RNA sarà estratto dai campioni di RNAprotect utilizzando colonne di affinità e digestione con DNAsi del DNA genomico. Per rilevare e quantificare gli stadi dei gametociti di P. falciparum, il giorno 0 e in tutti i campioni di follow-up verrà eseguita una qPCR di trascrizione inversa (RT-qPCR) mirata ai trascritti del gene Pfs25, seguendo i protocolli descritti in precedenza con le modifiche.

Saggi di sensibilità ai farmaci ex vivo: il sangue venoso raccolto in provette EDTA/ACD (al giorno 0 e al giorno della recidiva) verrà processato entro 6 ore dalla raccolta. Il sangue sarà centrifugato e il plasma e il buffy coat rimossi e conservati a -20ºC. I globuli rossi saranno lavati due volte in RPMI e risospesi in mezzo di coltura (mezzo liquido RPMI 1640 LPLF) in una miscela di mezzo di sangue con ematocrito al 50% (BMM).

Saggio standard di sensibilità ai farmaci ex vivo: la valutazione seguirà le linee guida dell'OMS "Field application of in vitro assay for the sensitivity of human malaria parasites to antimalarial drugs" per la valutazione della risposta di P. falciparum alle artemisinine".

Saggi ex vivo di sopravvivenza allo stadio dell'anello (RSA) Oltre ai saggi standard ex vivo, le prestazioni dei saggi di sopravvivenza allo stadio dell'anello (RSA) saranno esplorate seguendo un protocollo pubblicato.

Marcatori molecolari di resistenza all'artemisinina: il DNA estratto sarà utilizzato per genotipizzare le mutazioni puntiformi nel dominio dell'elica di P. falciparum Kelch (K13), che sono state recentemente identificate come marcatori molecolari candidati alla resistenza all'artemisinina. In breve, K13 sarà amplificato in una PCR nidificata utilizzando i primer descritti nella procedura WWARN INV11 [http://www.wwarn.org/toolkit/procedures]. Dopo la conferma dell'elettroforesi su gel di agarosio, i prodotti saranno sequenziati e analizzati per identificare i polimorfismi. Potrebbero essere esplorati anche futuri candidati alternativi per la resistenza all'artemisinina. 4. GARANZIA DI QUALITÀ Le visite di monitoraggio del sito saranno programmate su base regolare. Durante queste visite, le informazioni registrate sui moduli di segnalazione dei casi (CRF) saranno verificate rispetto ai documenti di origine (ad esempio registri di laboratorio e registri clinici). Dopo che i moduli CRF saranno stati raccolti al termine del processo, saranno esaminati per completezza e accuratezza. I dati saranno inseriti due volte in loco in un database elettronico (Epi Info), dove vengono utilizzati controlli informatici appositamente progettati per identificare discrepanze di inserimento dei dati, intervalli di dati non validi e coerenza complessiva. Tutte le discrepanze saranno risolte facendo riferimento ai moduli di raccolta dati originali controllati.

Tutti gli strisci di sangue al momento del ricovero verranno letti presso il sito dello studio e da un microscopista senior presso un centro di coordinamento. Inoltre, presso l'ITM verrà effettuato un controllo di qualità esterno sul 10% dei vetrini selezionati casualmente. Per ciascuno dei saggi molecolari (qPCR, RT-qPCR e genotipizzazione del parassita) il 10% dei campioni processati al NIMPE sarà scelto casualmente per essere analizzato nuovamente all'ITM. Il controllo di qualità esterno dei risultati del test farmacologico ex vivo verrà eseguito presso l'ITM, dove i vetrini verranno riesaminati per il 10% degli isolati scelti a caso.

5. Piano di analisi statistica Il tempo di eliminazione del parassita è definito come il tempo trascorso (in ore) dal momento del trattamento del paziente (prima dose) al primo di due vetrini negativi consecutivi. Il tempo e la velocità di eliminazione del parassita, nonché la fase di ritardo, saranno adattati utilizzando lo strumento online PCE sviluppato dal WWARN. L'analisi del tasso di guarigione a 42 giorni verrà eseguita sia per la popolazione di pazienti con intenzione di trattamento modificata (mITT) (tutti i pazienti randomizzati) sia per la popolazione di pazienti valutabili (per protocollo). I pazienti sono valutabili per l'analisi del tasso di guarigione in 28/42 giorni se i conteggi dei parassiti vengono registrati fino al giorno 26/40 o il paziente interrompe a causa di "effetto terapeutico insoddisfacente" a causa della ricomparsa dei parassiti. L'analisi mITT include anche i pazienti che interrompono prima del Giorno 28/42 per motivi diversi da "Effetto terapeutico insoddisfacente" (ad es. questo potrebbe includere "Esperienze avverse" a causa di vomito ripetuto). Questi pazienti verranno conteggiati nell'analisi mITT come trattamento fallito indipendentemente dal motivo dell'interruzione. I pazienti che hanno avuto un trattamento concomitante con antibiotici che hanno un effetto antimalarico saranno esclusi dai pazienti valutabili e inclusi nel mITT.

Per le variabili categoriali le percentuali ei corrispondenti intervalli di confidenza al 95% saranno calcolati utilizzando il metodo di Wilson. Le proporzioni saranno confrontate calcolando il *2 con la correzione di Yates o con il test esatto di Fisher ove appropriato. I dati continui normalmente distribuiti saranno riassunti come medie e deviazioni standard e confrontati con il test t di Student e l'analisi della varianza. I dati non conformi a una distribuzione normale saranno riassunti come mediane (IQR) o medie geometriche e confrontati con il test U di Mann-Whitney o l'analisi della varianza di Kruskal-Wallis. L'associazione tra 2 variabili continue sarà valutata utilizzando il coefficiente di correlazione per ranghi di Spearman.

Il rischio di fallimento del trattamento entro i giorni 28 e 42 sarà valutato mediante analisi di sopravvivenza con incidenze cumulative calcolate con il metodo Kaplan Meier e confrontate con il log rank test di Mantel-Haenszel.

Verranno valutati anche i tempi di clearance dei parassiti, della febbre e dei gametociti con il metodo Kaplan Meier.

I cambiamenti ematologici durante la prima settimana di trattamento e il recupero durante il follow-up settimanale saranno valutati misurando i cambiamenti nella concentrazione di Hb rispettivamente tra il giorno 0, 3, 7 e il giorno 14, 28 e 42.

6. QUESTIONI ETICHE Autorizzazioni etiche L'autorizzazione etica per condurre lo studio sarà stata ottenuta dal Comitato Etico dell'Istituto Nazionale di Malariologia, Parassitologia ed Entomologia, Hanoi e dell'Università di Anversa, nonché dall'Institutional Review Board dell'ITM , Anversa.

Consenso informato I pazienti saranno inclusi nello studio solo se loro (o genitori o tutori dei bambini) danno il consenso informato. La richiesta di consenso è disponibile in inglese e tradotta in lingua vietnamita sarà letta interamente al paziente, genitore o tutore. Saranno spiegati i dettagli sulla sperimentazione e sui suoi benefici e potenziali rischi. Dopo aver risposto a tutte le domande, verrà richiesta una firma sul documento. Se il paziente è analfabeta, deve firmare un testimone istruito; se possibile, il firmatario sarà selezionato dal partecipante e non avrà alcun legame con il gruppo di ricerca.