プロバイオティクス候補株を含む錠剤への影響

バックグラウンド：

ヒトの唾液は、細菌の相互作用や健康と病気のバイオマーカーを研究するための、簡単にアクセスでき、非侵襲的な機会を提供します。 ヒト マイクロバイオーム プロジェクトは、私たちの体の内外のバイオ フィルムが人類とともに進化し、健康にとって重要な役割を果たしているという洞察を提供しました。 これは口腔にも当てはまり、微生物叢は受動的な役割を果たすのではなく、口腔の健康の維持に積極的に貢献します。 しかし、マイクロバイオームにおける特定の生態学的変化により、病原体が出現し、口腔疾患を引き起こす可能性があります。 生態学的プラーク仮説によれば、う蝕と歯周炎は、それぞれ酸性種とタンパク質分解種の環境によって引き起こされる過剰増殖の結果です。

細菌療法は、他の微生物、特に病原体の干渉および/または阻害によって自然なマイクロバイオームを維持または回復するために、無害なエフェクター株を宿主の微生物叢に移植する場合に使用される用語です。 これにより、有害な副作用が少なく感染症と闘う別の方法が開かれる可能性があり、喘息、肥満、糖尿病など、細菌とは何の関係もないと思われる病気の治療にも役立つ可能性があります。 「適切な量を投与すると、宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」（WHO）として定義されるプロバイオティクス細菌は、細菌療法の候補として一般に提案されています。 潜在的な作用機序はまだ完全には理解されていませんが、局所的（直接的）効果と全身的（間接的）効果があることは明らかのようです。 Reid によれば、可能性のある手段は次のとおりです: i) 病原体との共凝集と増殖阻害、ii) バクテリオシンと過酸化水素の生成、iii) 接着部位と栄養に対する拮抗作用による競合排除、iv) 全身性免疫調節。

インビトロ研究では共凝集と成長阻害に対する効果が示され、臨床研究では歯肉炎症の臨床パラメーターに対する効果が示されていますが、免疫調節効果と宿主微生物相互作用についてはまだほとんどわかっていません。

歯周病は人間にとって最も蔓延している感染症の 1 つであり、歯の喪失につながる可能性があります。 歯肉炎を治療せずに放置すると歯周炎を引き起こす可能性があります。

口腔のさまざまな表面は常に唾液にさらされており、唾液中のいくつかの病原種は歯周病に関連していると考えられています。 口腔の健康に対するプロバイオティクス細菌の微生物効果に関する研究は、これまで従来の培養方法に基づいており、1 つまたは少数の菌株に焦点を当ててきました。 新しいハイスループット技術は、細菌プロファイルをより包括的かつ正確に把握する可能性を提供しますが、これまでに、プロバイオティクス細菌摂取後の唾液の細菌組成を決定するために配列決定を使用した研究はわずか数件しかありません。 ほとんどは、プロバイオティクス細菌を非常に短期間摂取した後に組成を分析します。 したがって、より長い介入期間後の組成を分析し、これを臨床転帰と相関させた研究は 1 つだけです。

標的：

研究の目的は、歯肉の炎症および歯肉溝液（GCF）中の選択された炎症促進性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのレベルに対する、プロバイオティクス候補株を含む錠剤の効果を調査することです。 第 2 の目的は、唾液マイクロバイオームに対する錠剤の効果を説明することです。 帰無仮説は、臨床測定値、サイトカインのレベル、および唾液の微生物組成はベースラインと、または研究グループと対照グループの間で異ならないということです。

研究デザイン:

研究は二重盲検法で計画されています。 2つの並行群を用いたプラセボ対照ランダム化試験。 介入期間は4週間を予定している。 研究計画は倫理的承認のために提出されます。

材料：

参加者は、歯学部の診療所および www.forsogsperson.dk を通じて患者の中から募集されます。 80人の参加者がインフォームドコンセント後に登録され、プロバイオティクスグループまたはプラセボグループのいずれかにランダムに割り当てられる予定です。 サンプルサイズは、以前に取得した BOP の値に基づいて検出力分析 (α= 0.05 および β=0.2) によって決定されました。 74 名の参加者が必要ですが、予想される脱落者を補うために 80 名が登録されています。

募集：研究に関する通知を読んだ参加者が研究に興味を示した場合、助教授で歯科医のメッテ・カースティン・ケラーとの説明会に招待されます。 予約の前に、説明会に同伴者を同伴する権利があることが参加者に通知されます。 彼らはまた、研究に関する書面による情報も受け取ります。 予約は、調査者、参加者、および場合によっては同伴者以外の人が出席しない会議室で行われます。 口頭での情報は書面による情報に基づいており、価値観を伴う用語を使用せず、平易な言葉で提供されます。 調査員は、プロジェクトを開始する前に、参加者が与えられたすべての情報を確実に理解していることを確認する責任があります。 参加者からのすべてのコメントは、情報インタビューと研究の両方で適切に考慮されます。 参加者はいつでもプロジェクトから撤退することができます。 治験への参加に関するインフォームド・コンセントは口頭および書面による情報に基づいて与えられ、そのような同意は少なくとも 24 時間の熟考時間の後に与えられます。 このプロジェクトには、身体的または精神的ハンディキャップのためにインフォームド・コンセントを与えることができない被験者は含まれていません。

方法:

介入：

インフォームドコンセント、ベースライン検査、サンプリングの後、参加者はランダムにいずれかの研究グループに割り当てられ、プロバイオティクス錠剤またはプラセボ錠剤のいずれかが与えられます。

プロバイオティクス錠剤には、Lactobacillus rhamnosus PB01 および Lactobacillus curvatus P2-2 が 1 * 109 CFU/錠剤の用量で含まれています。 菌株は、病原体の増殖阻害と免疫調節を調査するインビトロアッセイに基づいて選択されます。 プラセボ錠剤はサイズと組成が同じですが、プロバイオティクス株は添加されていません。 どちらのタブレットも Bifodan A/S によって提供されます。 参加者には、歯磨きの30分後に朝と夕方に1錠ずつ服用するよう指示されます。 錠剤は色分けされた同一のポットに詰められています。 コードは分析が完了するまで研究者に公開されません。

参加者は1日2錠を4週間服用します。 フォローアップ登録は 2 週間後、4 週間後、6 週間後に行われます。

臨床手順:

来院ごとに、唾液とGCF（歯肉溝液）が採取され、プラークインデックス（PI）とプロービング時出血（BOP）が記録されます。 GCF の収集では、各参加者から上切歯、犬歯、または小臼歯の対側の 2 つの頬側部位が選択されます。 選択した歯の歯肉縁上の歯垢を視覚的に除去し、その部位を綿ペレットで乾燥させます。 GCF は、歯肉溝に 20 秒間穏やかに挿入されたペリオペーパー ストリップ (ProFlow、Amityville、NY、USA) を使用して収集されます。 ストリップの位置はチャート上にマークされており、フォローアップ時に同じサンプル部位を確保できます。 血液が汚染されている場合は、ストリップが排出され、5 分後にサンプリングが繰り返されます。 GCF の体積は Peritron 8000 (Proflow) を使用して記録され、μL で表されます。 1 ストリップには約 0.1 ～ 0.4 が入ります。 μLのGCF。 次にストリップをプラスチックチューブに移し、さらなる分析まで-80℃で保存します。

唾液サンプルの場合、食物摂取後少なくとも 2 時間後に、パラフィンで刺激した全唾液を 3 分間採取します。 通常の唾液量の目安は、3分後に3～6mlになります。 収集した唾液は 1.5 ml ずつに分けて直ちに凍結され、さらなる分析まで -80℃ で保存されます。 残りのサンプルは研究終了後に破棄されます。

検査手順:

GCF 上のサイトカインの分析: 吸収された GCF は、0.05 % Tween 20 を含む 120 μL PBS (リン酸緩衝生理食塩水) で溶出されます。 INFγ、TNF-α、IL-8、IL-10およびIL-12のレベルは、luminexおよびマルチプレックスイムノアッセイパネル(LINCOplex、LINCO Research, Inc、USA)を製造業者のマニュアルに従って使用して測定する。 サイトカインの濃度は pg/ml として表されます。

唾液マイクロバイオームの分析: 系統発生マーカー遺伝子 16S rRNA のアンプリコン配列決定を通じて、2 つの試験グループにおける全微生物群集の組成と安定性を同定および比較するために、2 ml の解凍唾液サンプルから全細菌 DNA が抽出されます。 細菌および古細菌の 16S rRNA 遺伝子の超可変領域 V3 ～ V4 は、特定のプライマー 341F および 806R を使用して PCR 増幅され、コペンハーゲン大学微生物学のパートナーが最先端の技術に基づいて開発した確立されたハイスループット シーケンス パイプラインによって分析されます。シーケンス技術 (Illumina Mi-Seq) と、大規模なマイクロバイオーム データセットの分析用に特別に設計されたカスタムメイドのバイオインフォマティクス ツール。

統計的手法:

すべてのデータは SPSS ソフトウェア (v 22.0; 米国イリノイ州シカゴ) で処理されます。 追跡値は、ウィルコクソンの対応のある両側検定によって各グループ内のベースラインと比較され、グループ間の差異はウィルコクソンの対応のない検定によって分析されます。 p 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

データ管理：

収集されたすべてのデータは、個人データの処理に関する法律および「健康法」に従って扱われます。 参加者には、参加者に固有の番号と、個人識別番号のない別のプロトコルが割り当てられます。

科学的重要性:

この研究は、プロバイオティクス錠剤が歯肉炎症の臨床マーカーや炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインに影響を与える可能性があるという証拠を提供する可能性があり、歯肉炎の管理や口腔の健康維持における新たな戦略につながる可能性がある。 歯科疾患の治療におけるプロバイオティクス細菌の使用は、抗生物質の使用の 1 つの選択肢となる可能性があります。 さらに、細菌療法において重要な出来事であると考えられている、唾液マイクロバイオームへの新株導入の影響についての新たな洞察が得られるだろう。

リスクと悪影響:

参加者は歯学部の患者保険で全額補償されており、研究中に治験参加者が受けた損害はすべて補償されます。プロバイオティクスによる治療で予想される副作用はありません。 プロバイオティクスは、欧州食品安全機関 (EFSA) によって一般に安全であると考えられています (GRAS: 一般に安全と認められています)。

参加者は予期せぬ悪影響を報告するよう求められます。

倫理的配慮：

参加者は治療から直接利益を得ることはできませんが、研究から得られた知識は、口腔内の微生物由来の病気の予防に貢献する可能性があります。 将来的には虫歯や歯周病に。 サンプル採取は参加者に不快感を与えることはなく、錠剤には既知の副作用もありません。 したがって、参加者の個人的な利益は、参加者にとって最小限のリスクと不快感に相当します。 トライアルを完了した参加者には、Magasin に 500 DKK のギフト券が贈られます。 肯定的、否定的、および決定的ではない結果が公表されることを強調する必要があります。

タイムスケジュール：

研究の準備は2014/2015年の冬に行われる予定です。 倫理的承認後、2015年の冬から春にかけて患者を研究に募集することができる。