Effetti sulle compresse contenenti ceppi candidati probiotici

Sfondo:

La saliva umana offre un'opportunità facilmente accessibile e non invasiva per studiare le interazioni batteriche e i biomarcatori di salute e malattia. Il progetto Human Microbiome ha fornito informazioni sul fatto che i biofilm all'interno e all'esterno del nostro corpo si sono co-evoluti con l'umanità e svolgono un ruolo importante per la salute. Questo vale anche per il cavo orale in cui il microbiota non svolge un ruolo passivo ma contribuisce attivamente al mantenimento della salute orale. Tuttavia, alcuni cambiamenti ecologici nel microbioma consentono ai patogeni di manifestarsi e causare malattie orali. Secondo l'ipotesi della placca ecologica, la carie e la parodontite sono rispettivamente il risultato di una crescita eccessiva indotta dall'ambiente di specie aciduriche e proteolitiche.

Batterioterapia è il termine utilizzato quando un ceppo effettore innocuo viene impiantato nella microflora dell'ospite per mantenere o ripristinare un microbioma naturale mediante l'interferenza e/o l'inibizione di altri microrganismi, e in particolare di agenti patogeni. Questo potrebbe aprire strade alternative per combattere le malattie infettive con effetti collaterali meno dannosi e potrebbe anche aiutare nel trattamento di disturbi che sembrano non avere nulla a che fare con i batteri, come l'asma, l'obesità e il diabete. I batteri probiotici, definiti come "microrganismi vivi che, se somministrati in quantità adeguate, conferiscono un beneficio per la salute dell'ospite" (WHO), sono candidati comunemente suggeriti per la batterioterapia. I potenziali meccanismi d'azione non sono ancora del tutto chiari, ma sembra chiaro che vi siano effetti locali (diretti) e sistemici (indiretti). Secondo Reid le potenziali vie sono: i) co-aggregazione con agenti patogeni e inibizione della crescita, ii) produzione di batteriocina e perossido di idrogeno, iii) esclusione competitiva attraverso attività antagonistiche sui siti di adesione e nutrizione, iv) immunomodulazione sistemica.

Studi in vitro hanno mostrato effetti sulla co-aggregazione e sull'inibizione della crescita e studi clinici hanno mostrato effetti sui parametri clinici dell'infiammazione gengivale, ma si sa ancora poco sull'effetto immunomodulatore e sull'interazione ospite-microbo.

Le malattie parodontali sono tra le malattie infettive più diffuse nell'uomo e possono portare alla perdita dei denti. Se la gengivite non trattata può portare alla parodontite.

Le diverse superfici della cavità orale sono tutte continuamente bagnate dalla saliva e diverse specie patogene nella saliva sono state associate alla malattia parodontale. Gli studi sull'effetto microbico dei batteri probiotici sulla salute orale si sono finora basati su metodi di coltivazione convenzionali e si sono concentrati su uno o pochi ceppi. Le nuove tecniche ad alto rendimento offrono la possibilità di un quadro più completo e preciso dei profili batterici, ma ad oggi solo pochi studi hanno utilizzato il sequenziamento per determinare la composizione batterica della saliva dopo l'assunzione di batteri probiotici. La maggior parte analizza la composizione dopo un'assunzione a brevissimo termine dei batteri probiotici. Pertanto, esiste un solo studio che ha analizzato la composizione dopo un periodo di intervento più lungo e lo ha correlato ai risultati clinici.

Scopo:

Lo scopo dello studio è quello di indagare l'effetto di compresse contenenti ceppi candidati probiotici, sull'infiammazione gengivale e sui livelli di citochine pro e antinfiammatorie selezionate nel fluido crevicolare gengivale (GCF). Un obiettivo secondario è descrivere l'effetto delle compresse sul microbioma salivare. L'ipotesi nulla è che le misurazioni cliniche, i livelli di citochine e la composizione microbica della saliva non differiranno dal basale o tra lo studio e il gruppo di controllo.

Disegno dello studio:

Lo studio è pianificato in doppio cieco; trial randomizzato controllato con placebo a due bracci paralleli. Il periodo di intervento è previsto in 4 settimane. Il piano di studi sarà sottoposto ad approvazione etica.

Materiale:

I partecipanti saranno reclutati tra i pazienti presso la clinica della School of Dentistry e tramite www.forsogsperson.dk. È previsto che 80 partecipanti vengano arruolati dopo il consenso informato e quindi assegnati in modo casuale al gruppo probiotico o al gruppo placebo. La dimensione del campione è stata determinata mediante un'analisi di potenza (α= 0,05 e β=0,2) basata sui valori di BOP ottenuti in precedenza. Sono necessari 74 partecipanti e 80 iscritti per compensare gli abbandoni previsti.

Reclutamento: se i partecipanti dopo aver letto l'avviso sullo studio esprimono interesse per lo studio, saranno invitati a un appuntamento informativo con l'assistente professore e dentista Mette Kirstine Keller. Prima dell'appuntamento, i partecipanti saranno informati che hanno il diritto di portare un accompagnatore all'incontro informativo. Riceveranno anche le informazioni scritte sullo studio. L'appuntamento avverrà in una sala riunioni senza che siano presenti altre persone oltre allo sperimentatore, al partecipante ed eventualmente a un accompagnatore. Le informazioni orali si baseranno sulle informazioni scritte e saranno fornite in un linguaggio semplice senza termini carichi di valore. Il ricercatore è responsabile di garantire che il partecipante abbia compreso tutte le informazioni fornite prima dell'inizio del progetto. Tutti i commenti del partecipante vengono presi in considerazione in modo rilevante sia durante l'intervista informativa che durante lo studio. In qualsiasi momento il partecipante può recedere dal progetto. Il consenso informato alla partecipazione alla sperimentazione è dato sulla base di informazioni orali e scritte, e tale consenso può essere dato dopo almeno 24 ore di tempo di riflessione. Il progetto non include soggetti che, a causa di handicap fisici o psichici, non possono prestare il consenso informato.

Metodi:

Intervento:

Dopo il consenso informato, l'esame di base e il campionamento, i partecipanti vengono assegnati in modo casuale a uno dei gruppi di studio e ricevono una fornitura di compresse probiotiche o compresse placebo.

Le compresse probiotiche contengono Lactobacillus rhamnosus PB01 e Lactobacillus curvatus P2-2 alla dose di 1 * 109 UFC/compressa. I ceppi vengono scelti sulla base di saggi in vitro che studiano l'inibizione della crescita dei patogeni e l'immunomodulazione. Le compresse placebo sono identiche per dimensioni e composizione ma senza l'aggiunta dei ceppi probiotici. Entrambe le compresse sono fornite da Bifodan A/S. I partecipanti verranno istruiti a prendere una compressa al mattino e una alla sera trenta minuti dopo la spazzolatura dei denti. Le compresse sono confezionate in vasetti identici con codice colore. Il codice sarà tenuto agli investigatori fino al termine dell'analisi.

I partecipanti prenderanno due compresse al giorno per quattro settimane. Le registrazioni di follow-up vengono condotte dopo due settimane, quattro settimane e sei settimane.

Procedure cliniche:

Ad ogni visita verranno raccolti saliva e GCF (Gingival Crevicular Fluid) e successivamente verranno registrati l'indice di placca (PI)) e il sanguinamento al sondaggio (BOP). Per la raccolta di GCF, verranno selezionati da ciascun partecipante due siti buccali controlaterali dagli incisivi, canini o premolari superiori. La placca sopragengivale visiva sui denti selezionati verrà rimossa e i siti verranno asciugati con palline di cotone. GCF sarà raccolto utilizzando strisce periopaper (ProFlow, Amityville, NY, USA) inserite delicatamente nel solco gengivale per 20 s. La posizione della striscia è contrassegnata su un grafico per garantire lo stesso sito di campionamento ai follow-up. In caso di contaminazione del sangue, la striscia viene scaricata e il prelievo viene ripetuto dopo 5 min. Il volume di GCF viene registrato utilizzando un Peritron 8000 (Proflow) ed espresso in μL. Una striscia contiene circa 0,1-0,4 microlitri GCF. Le strisce vengono quindi trasferite in provette di plastica e conservate a -80ºC fino a ulteriore analisi.

Per i campioni di saliva, la saliva intera stimolata con paraffina viene raccolta per un periodo di 3 minuti almeno due ore dopo ogni assunzione di cibo. La quantità approssimativa di saliva a velocità normale sarà di 3-6 ml dopo 3 minuti. La saliva raccolta viene immediatamente congelata in aliquote da 1,5 ml e conservata a -80ºC fino a ulteriori analisi. Il resto del campione sarà distrutto dopo il completamento dello studio.

Procedure di laboratorio:

Analisi delle citochine su GCF: il GCF assorbito viene eluito in 120 μL di PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) contenente lo 0,05% di Tween 20. I livelli di INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 e IL-12 sono determinati utilizzando pannelli di dosaggio immunologico luminex e multiplex (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) in conformità con il manuale del produttore. Le concentrazioni delle citochine sono espresse come pg/ml.

Analisi del microbioma salivare: Il DNA batterico totale sarà estratto da 2 ml di campione di saliva scongelato per l'identificazione e il confronto della composizione e stabilità delle comunità microbiche totali nei due gruppi sperimentali attraverso il sequenziamento dell'amplicone del gene marcatore filogenetico 16S rRNA. La regione ipervariabile V3-V4 dei geni 16S rRNA batterici e arcaici sarà amplificata mediante PCR utilizzando primer specifici 341F e 806R e analizzata mediante una pipeline di sequenziamento ad alto rendimento sviluppata dal partner di microbiologia dell'Università di Copenaghen basata sullo stato dell'arte tecnologie di sequenziamento (Illumina Mi-Seq) e strumenti bioinformatici personalizzati specificamente progettati per l'analisi di grandi set di dati del microbioma.

Metodi statistici:

Tutti i dati verranno elaborati con il software SPSS (v 22.0; Chicago, Ill, USA). I valori di follow-up vengono confrontati con il basale all'interno di ciascun gruppo mediante il test Wilcoxon paired two-sided e le differenze tra i gruppi vengono analizzate mediante il test Wilcoxon unpaired. Un p-value <0,05 è considerato statisticamente significativo.

Gestione dati:

Tutti i dati raccolti saranno trattati nel rispetto della Legge sul Trattamento dei Dati Personali e della "Legge sulla Salute". All'atto dell'inclusione ai partecipanti verrà assegnato un numero univoco e un protocollo separato senza numero di identificazione personale.

Importanza scientifica:

Lo studio potrebbe fornire la prova che le compresse di probiotici possono influenzare i marcatori clinici dell'infiammazione gengivale e/o le citochine pro e antinfiammatorie, il che può portare a nuove strategie nella gestione della gengivite e nel mantenimento della salute orale. L'uso di batteri probiotici nel trattamento delle malattie dentali potrebbe essere un'opzione per l'uso di antibiotici. Inoltre fornirà nuove informazioni sull'effetto dell'introduzione di nuovi ceppi nel microbioma salivare che dovrebbe essere un evento significativo nella batterioterapia.

Rischi ed effetti avversi:

I partecipanti sono completamente coperti dall'assicurazione del paziente di The School of Dentistry che copre eventuali danni al partecipante alla sperimentazione durante lo studio. Non sono previsti effetti collaterali al trattamento con probiotici. I probiotici sono generalmente considerati sicuri (GRAS: Generally Recognized As Safe) dall'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA).

Ai partecipanti verrà chiesto di segnalare qualsiasi effetto avverso inaspettato.

Considerazioni etiche:

I partecipanti non beneficeranno direttamente del trattamento, ma le conoscenze acquisite dallo studio potrebbero contribuire alla prevenzione delle malattie di origine microbica in bocca, ad es. carie e parodontite, in futuro. La raccolta del campione non provoca alcun disagio ai partecipanti e le compresse non hanno effetti collaterali noti. Pertanto, il vantaggio personale dei partecipanti corrisponde al minimo rischio e disagio per i partecipanti. I partecipanti che completeranno la prova saranno ricompensati con un buono regalo di 500 DKK a Magasin. Va sottolineato che i risultati positivi, negativi e inconcludenti saranno pubblicati.

Orario:

La preparazione dello studio sarà effettuata nell'inverno 2014/2015. Dopo l'approvazione etica, i pazienti possono essere reclutati nello studio durante l'inverno/primavera 2015.