Auswirkungen auf Tabletten, die probiotische Kandidatenstämme enthalten

Hintergrund:

Der menschliche Speichel bietet eine leicht zugängliche und nicht-invasive Möglichkeit, bakterielle Wechselwirkungen sowie Biomarker für Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. Das Human Microbiome Project hat Erkenntnisse darüber geliefert, dass sich die Biofilme innerhalb und außerhalb unseres Körpers gemeinsam mit der Menschheit entwickelt haben und eine wichtige Rolle für die Gesundheit spielen. Dies gilt auch für die Mundhöhle, in der die Mikrobiota keine passive Rolle spielt, sondern aktiv zur Erhaltung der Mundgesundheit beiträgt. Bestimmte ökologische Veränderungen im Mikrobiom ermöglichen jedoch die Manifestation von Krankheitserregern und verursachen Munderkrankungen. Gemäß der ökologischen Plaque-Hypothese sind Karies und Parodontitis das Ergebnis einer umweltbedingten Überwucherung saurer bzw. proteolytischer Spezies.

Unter Bakteriotherapie versteht man die Implantation eines harmlosen Effektorstamms in die Mikroflora des Wirts, um ein natürliches Mikrobiom durch Eingriff und/oder Hemmung anderer Mikroorganismen, insbesondere Krankheitserreger, aufrechtzuerhalten oder wiederherzustellen. Dies könnte alternative Wege zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten mit weniger schädlichen Nebenwirkungen eröffnen und auch bei der Behandlung von Erkrankungen helfen, die scheinbar nichts mit Bakterien zu tun haben, wie Asthma, Fettleibigkeit und Diabetes. Probiotische Bakterien, definiert als „lebende Mikroorganismen, die, wenn sie in ausreichenden Mengen verabreicht werden, dem Wirt einen gesundheitlichen Nutzen verleihen“ (WHO), werden häufig als Kandidaten für eine Bakteriotherapie empfohlen. Die möglichen Wirkmechanismen sind noch nicht vollständig geklärt, es scheint jedoch klar, dass es sowohl lokale (direkte) als auch systemische (indirekte) Auswirkungen gibt. Laut Reid sind die möglichen Wege: i) Co-Aggregation mit Krankheitserregern und Wachstumshemmung, ii) Bakteriocin- und Wasserstoffperoxidproduktion, iii) Konkurrenzausschluss durch antagonistische Aktivitäten an Adhäsionsstellen und Ernährung, iv) systemische Immunmodulation.

In-vitro-Studien haben eine Wirkung auf die Co-Aggregation und Wachstumshemmung gezeigt, und klinische Studien haben eine Wirkung auf die klinischen Parameter einer Zahnfleischentzündung gezeigt, aber über die immunmodulatorische Wirkung und die Wirt-Mikroben-Interaktion ist noch wenig bekannt.

Parodontale Erkrankungen gehören zu den am weitesten verbreiteten Infektionskrankheiten des Menschen und können zum Zahnverlust führen. Unbehandelt kann eine Gingivitis zu einer Parodontitis führen.

Die verschiedenen Oberflächen der Mundhöhle sind alle ständig mit Speichel umspült und mehrere pathogene Spezies im Speichel wurden mit Parodontitis in Verbindung gebracht. Studien zur mikrobiellen Wirkung probiotischer Bakterien auf die Mundgesundheit basierten bislang auf konventionellen Kultivierungsmethoden und konzentrierten sich auf einen oder wenige Stämme. Die neuen Hochdurchsatztechniken bieten die Möglichkeit, ein umfassenderes und präziseres Bild der Bakterienprofile zu erhalten. Bisher wurde jedoch nur in wenigen Studien die Sequenzierung zur Bestimmung der bakteriellen Zusammensetzung des Speichels nach Einnahme probiotischer Bakterien eingesetzt. Die meisten analysieren die Zusammensetzung nach einer sehr kurzfristigen Einnahme der probiotischen Bakterien. Daher gibt es nur eine Studie, die die Zusammensetzung nach längerer Interventionsdauer analysiert und diese mit den klinischen Ergebnissen korreliert hat.

Ziel:

Ziel der Studie ist es, die Wirkung von Tabletten, die probiotische Kandidatenstämme enthalten, auf Zahnfleischentzündungen und die Konzentration ausgewählter pro- und antiinflammatorischer Zytokine in der Zahnfleischspaltenflüssigkeit (GCF) zu untersuchen. Ein sekundäres Ziel besteht darin, die Wirkung der Tabletten auf das Speichelmikrobiom zu beschreiben. Die Nullhypothese besagt, dass sich die klinischen Messungen, Zytokinspiegel und die mikrobielle Zusammensetzung des Speichels nicht vom Ausgangswert oder zwischen der Studien- und der Kontrollgruppe unterscheiden.

Studiendesign:

Die Studie ist als Doppelblindstudie geplant; Placebokontrollierte, randomisierte Studie mit zwei parallelen Armen. Der Interventionszeitraum ist auf 4 Wochen ausgelegt. Der Studienplan wird zur ethischen Genehmigung vorgelegt.

Material:

Die Teilnehmer werden unter Patienten in der Klinik der School of Dentistry und über www.forsogsperson.dk rekrutiert. Es ist geplant, 80 Teilnehmer nach Einverständniserklärung einzuschreiben und dann nach dem Zufallsprinzip entweder der Probiotikagruppe oder der Placebogruppe zuzuordnen. Die Probengröße wurde durch eine Leistungsanalyse (α = 0,05 und β = 0,2) basierend auf zuvor erhaltenen BOP-Werten bestimmt. Es werden 74 Teilnehmer benötigt und 80 eingeschrieben, um die erwarteten Abbrecher auszugleichen.

Rekrutierung: Wenn die Teilnehmer nach dem Lesen der Bekanntmachung über die Studie Interesse an der Studie bekunden, werden sie zu einem Informationstermin mit der Assistenzprofessorin und Zahnärztin Mette Kirstine Keller eingeladen. Vor dem Termin werden die Teilnehmer darüber informiert, dass sie das Recht haben, eine Begleitperson zur Informationsveranstaltung mitzubringen. Sie erhalten auch die schriftlichen Informationen zur Studie. Der Termin findet in einem Besprechungsraum statt, in dem außer dem Prüfer, dem Teilnehmer und ggf. einer Begleitperson keine weiteren Personen anwesend sind. Die mündlichen Informationen basieren auf den schriftlichen Informationen und werden in einfacher Sprache ohne wertbetonte Begriffe erteilt. Der Prüfer ist dafür verantwortlich, sicherzustellen, dass der Teilnehmer vor Beginn des Projekts alle gegebenen Informationen verstanden hat. Alle Kommentare des Teilnehmers werden sowohl im Informationsgespräch als auch in der Studie relevant berücksichtigt. Der Teilnehmer kann jederzeit vom Projekt zurücktreten. Die Einwilligung zur Teilnahme an der Studie erfolgt auf der Grundlage mündlicher und schriftlicher Informationen und kann nach einer Bedenkzeit von mindestens 24 Stunden erteilt werden. Das Projekt umfasst keine Probanden, die aufgrund einer körperlichen oder geistigen Behinderung keine Einwilligung nach Aufklärung erteilen können.

Methoden:

Intervention:

Nach informierter Einwilligung, Basisuntersuchung und Probenahme werden die Teilnehmer nach dem Zufallsprinzip einer der Studiengruppen zugeteilt und erhalten entweder probiotische Tabletten oder Placebo-Tabletten.

Die probiotischen Tabletten enthalten Lactobacillus rhamnosus PB01 und Lactobacillus curvatus P2-2 in einer Dosis von 1 * 109 KBE/Tablette. Die Auswahl der Stämme basiert auf In-vitro-Tests, die die Wachstumshemmung von Krankheitserregern und die Immunmodulation untersuchen. Die Placebotabletten sind in Größe und Zusammensetzung identisch, jedoch ohne Zusatz der probiotischen Stämme. Beide Tabletten werden von Bifodan A/S bereitgestellt. Die Teilnehmer werden angewiesen, dreißig Minuten nach dem Zähneputzen jeweils eine Tablette morgens und eine abends einzunehmen. Die Tabletten sind in identischen Behältern mit Farbmarkierung verpackt. Der Code wird den Ermittlern bis zum Abschluss der Analyse vorenthalten.

Die Teilnehmer nehmen vier Wochen lang täglich zwei Tabletten ein. Nachmeldungen erfolgen nach zwei Wochen, vier Wochen und sechs Wochen.

Klinische Verfahren:

Bei jedem Besuch werden Speichel und GCF (Gingival Crevicular Fluid) gesammelt und anschließend der Plaque-Index (PI) und die Blutung beim Sondieren (BOP) registriert. Für die Sammlung von GCF werden von jedem Teilnehmer zwei kontralaterale bukkale Stellen der oberen Schneidezähne, Eckzähne oder Prämolaren ausgewählt. An den ausgewählten Zähnen wird visueller supragingivaler Zahnbelag entfernt und die Stellen werden mit Wattepellets getrocknet. GCF wird mithilfe von Periopapierstreifen (ProFlow, Amityville, NY, USA) gesammelt, die 20 s lang vorsichtig in den Zahnfleischsulkus eingeführt werden. Die Position des Streifens wird auf einer Karte markiert, um bei den Nachuntersuchungen die identische Probenstelle sicherzustellen. Im Falle einer Blutkontamination wird der Streifen entladen und die Probenahme nach 5 Minuten wiederholt. Das GCF-Volumen wird mit einem Peritron 8000 (Proflow) aufgezeichnet und in μL ausgedrückt. Ein Streifen fasst ca. 0,1-0,4 μL GCF. Anschließend werden die Streifen in Kunststoffröhrchen überführt und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert.

Für die Speichelproben wird mit Paraffin stimulierter Vollspeichel über einen Zeitraum von 3 Minuten, mindestens zwei Stunden nach jeder Nahrungsaufnahme, gesammelt. Die ungefähre Speichelmenge beträgt bei normaler Geschwindigkeit nach 3 Minuten 3-6 ml. Der gesammelte Speichel wird sofort in 1,5-ml-Aliquots eingefroren und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C gelagert. Der Rest der Probe wird nach Abschluss der Studie vernichtet.

Laborverfahren:

Analyse von Zytokinen auf GCF: Der absorbierte GCF wird in 120 μL PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) mit 0,05 % Tween 20 eluiert. Die Konzentrationen von INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 und IL-12 werden unter Verwendung von Luminex- und Multiplex-Immunoassay-Panels (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) gemäß dem Handbuch des Herstellers bestimmt. Die Konzentrationen der Zytokine werden in pg/ml angegeben.

Analyse des Speichelmikrobioms: Die gesamte bakterielle DNA wird aus 2 ml aufgetauter Speichelprobe extrahiert, um die Zusammensetzung und Stabilität der gesamten mikrobiellen Gemeinschaften in den beiden Versuchsgruppen durch Amplikonsequenzierung des phylogenetischen Markergens 16S rRNA zu identifizieren und zu vergleichen. Die hypervariable Region V3-V4 der bakteriellen und archaealen 16S-rRNA-Gene wird mit den spezifischen Primern 341F und 806R PCR-amplifiziert und durch eine etablierte Hochdurchsatz-Sequenzierungspipeline analysiert, die vom Mikrobiologiepartner der Universität Kopenhagen auf der Grundlage modernster Erkenntnisse entwickelt wurde Sequenzierungstechnologien (Illumina Mi-Seq) und maßgeschneiderte bioinformatische Tools, die speziell für die Analyse großer Mikrobiom-Datensätze entwickelt wurden.

Statistische Methoden:

Alle Daten werden mit der SPSS-Software (Version 22.0; Chicago, Illinois, USA) verarbeitet. Die Follow-up-Werte werden innerhalb jeder Gruppe mit dem gepaarten zweiseitigen Wilcoxon-Test mit dem Ausgangswert verglichen und die Unterschiede zwischen den Gruppen werden mit dem ungepaarten Wilcoxon-Test analysiert. Ein p-Wert < 0,05 gilt als statistisch signifikant.

Datenmanagement:

Alle gesammelten Daten werden in Übereinstimmung mit dem Gesetz über die Verarbeitung personenbezogener Daten und dem „Gesundheitsgesetz“ behandelt. Bei der Aufnahme wird den Teilnehmern eine eindeutige Nummer und ein separates Protokoll ohne persönliche Identifikationsnummer zugewiesen.

Wissenschaftliche Bedeutung:

Die Studie könnte Hinweise darauf liefern, dass die probiotischen Tabletten klinische Marker für Zahnfleischentzündungen und/oder pro- und antiinflammatorische Zytokine beeinflussen können, was zu neuen Strategien bei der Behandlung von Gingivitis und der Erhaltung der Mundgesundheit führen kann. Der Einsatz probiotischer Bakterien bei der Behandlung von Zahnerkrankungen könnte eine Alternative zum Einsatz von Antibiotika sein. Darüber hinaus wird es neue Erkenntnisse über die Wirkung der Einführung neuer Stämme auf das Speichelmikrobiom liefern, was ein bedeutendes Ereignis in der Bakteriotherapie sein soll.

Risiken und Nebenwirkungen:

Die Teilnehmer sind vollständig durch die Patientenversicherung der School of Dentistry abgesichert, die alle Schäden abdeckt, die dem Studienteilnehmer während der Studie entstehen. Es sind keine Nebenwirkungen bei der Behandlung mit Probiotika zu erwarten. Probiotika werden von der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) allgemein als sicher eingestuft (GRAS: Generally Recognized As Safe).

Die Teilnehmer werden gebeten, unerwartete Nebenwirkungen zu melden.

Ethische Überlegungen:

Die Teilnehmer werden nicht direkt von der Behandlung profitieren, aber die aus der Studie gewonnenen Erkenntnisse könnten zur Vorbeugung mikrobieller Erkrankungen im Mund beitragen, z.B. Karies und Parodontitis. Die Probenentnahme verursacht für die Teilnehmer keine Beschwerden und die Tabletten haben keine bekannten Nebenwirkungen. Daher entspricht der persönliche Nutzen der Teilnehmer dem minimalen Risiko und Unbehagen für die Teilnehmer. Die Teilnehmer, die die Testversion abschließen, werden mit einem Geschenkgutschein im Wert von 500 DKK an Magasin entschädigt. Es ist zu betonen, dass positive, negative und nicht schlüssige Ergebnisse veröffentlicht werden.

Zeitplan:

Die Vorbereitung der Studie wird im Winter 2014/2015 erfolgen. Nach der ethischen Genehmigung können im Winter/Frühjahr 2015 Patienten für die Studie rekrutiert werden.