Effekter på tabletter som inneholder probiotiske kandidatstammer

Bakgrunn:

Menneskets spytt gir en lett tilgjengelig og ikke-invasiv mulighet til å studere bakterielle interaksjoner samt biomarkører for helse og sykdom. Human Microbiome Project har gitt innsikt i at biofilmene i og utenfor kroppen vår har utviklet seg sammen med menneskeheten og spiller en viktig rolle for helsen. Dette gjelder også for munnhulen der mikrobiotaen ikke spiller en passiv rolle, men aktivt bidrar til å opprettholde munnhelsen. Imidlertid tillater visse økologiske endringer i mikrobiomet patogener å manifestere seg og forårsake orale sykdommer. I følge den økologiske plakkhypotesen er karies og periodontitt et resultat av miljøindusert overvekst av henholdsvis surholdige og proteolytiske arter.

Bakterioterapi er betegnelsen som brukes når en ufarlig effektorstamme implanteres i vertens mikroflora for å opprettholde eller gjenopprette et naturlig mikrobiom ved interferens og/eller hemming av andre mikroorganismer, og spesielt patogener. Dette kan åpne for alternative måter å bekjempe infeksjonssykdommer med mindre skadelige bivirkninger og kan også hjelpe i behandlingen av lidelser som ikke ser ut til å ha noe med bakterier å gjøre, som astma, fedme og diabetes. Probiotiske bakterier, definert som "Levende mikroorganismer som, når de administreres i tilstrekkelige mengder, gir en helsegevinst for verten" (WHO), er ofte foreslåtte kandidater for bakterioterapi. De potensielle virkningsmekanismene er fortsatt ikke fullt ut forstått, men det synes klart at det er lokale (direkte) så vel som systemiske (indirekte) effekter. I følge Reid er de potensielle veiene: i) koaggregering med patogener og vekstinhibering, ii) produksjon av bakteriocin og hydrogenperoksid, iii) konkurranseutstenging gjennom antagonistiske aktiviteter på adhesjonssteder og ernæring, iv) systemisk immunmodulering.

In vitro-studier har vist effekt på koaggregasjon og vekstinhibering og kliniske studier har vist effekt på kliniske parametere for gingival betennelse, men fortsatt er lite kjent om den immunmodulerende effekten og vert-mikrobe-interaksjonen.

Periodontale sykdommer er blant de mest utbredte infeksjonssykdommene hos mennesker og kan føre til tap av tenner. Hvis ubehandlet gingivitt kan føre til periodontitt.

De forskjellige overflatene av munnhulen er alle kontinuerlig badet i spytt og flere patogene arter i spytt har blitt assosiert med periodontal sykdom. Studier av den mikrobielle effekten av probiotiske bakterier på munnhelsen har så langt vært basert på konvensjonelle dyrkingsmetoder og har vært fokusert på en eller noen få stammer. De nye high-throughput-teknikkene gir mulighet for mer omfattende og presist bilde av bakterieprofilene, men til dags dato har kun noen få studier brukt sekvensering for å bestemme bakteriesammensetningen av spytt etter inntak av probiotiske bakterier. De fleste analyserer sammensetningen etter et svært kortvarig inntak av de probiotiske bakteriene. Derfor er det bare én studie som har analysert sammensetningen etter lengre intervensjonsperiode og korrelert dette med kliniske utfall.

Mål:

Målet med studien er å undersøke effekten av tabletter som inneholder probiotiske kandidatstammer, på gingivalbetennelse og nivåene av utvalgte pro- og antiinflammatoriske cytokiner i gingival crevicular fluid (GCF). Et sekundært mål er å beskrive effekten av tablettene på spyttmikrobiomet. Nullhypotesen er at de kliniske målingene, nivåene av cytokiner og mikrobiell sammensetning av spytt ikke vil avvike fra baseline eller mellom studien og kontrollgruppen.

Studere design:

Studiet er planlagt som en dobbeltblind; placebokontrollert randomisert studie med to parallelle armer. Intervensjonsperioden er planlagt å være 4 uker. Studieplanen vil bli forelagt for etisk godkjenning.

Materiale:

Deltakerne vil bli rekruttert blant pasienter ved klinikken ved Tannlegeskolen og gjennom www.forsogsperson.dk. 80 deltakere er planlagt å bli registrert etter informert samtykke og deretter tilfeldig fordelt til enten probiotikagruppen eller placebogruppen. Prøvestørrelse ble bestemt ved en kraftanalyse (α=0,05 og β=0,2) basert på verdier av BOP oppnådd tidligere. Syttifire deltakere trengs og 80 er påmeldt for å kompensere for forventet frafall.

Rekruttering: Dersom deltakerne etter å ha lest kunngjøringen om studien uttrykker interesse for studien vil de bli invitert til en informasjonstime med adjunkt og tannlege Mette Kirstine Keller. Deltagerne vil i forkant av tilsettingen bli informert om at de har rett til å ta med ledsager til informasjonsmøtet. De vil også motta den skriftlige informasjonen om studien. Oppnevningen vil skje i møterom uten andre tilstede enn etterforsker, deltaker og eventuelt ledsager. Den muntlige informasjonen vil være basert på den skriftlige informasjonen og gis på et enkelt språk uten noen verdiladede uttrykk. Utreder er ansvarlig for at deltakeren har forstått all gitt informasjon før prosjektet starter. Alle kommentarer fra deltakeren tas i relevant vurdering både under informasjonsintervjuet og studien. Deltakeren kan når som helst trekke seg fra prosjektet. Det informerte samtykket for deltakelse i rettssaken gis på grunnlag av muntlig og skriftlig informasjon, og slikt samtykke kan gis etter minst 24 timers betenkningstid. Prosjektet omfatter ikke forsøkspersoner som på grunn av fysisk eller psykisk funksjonshemming ikke kan gi informert samtykke.

Metoder:

Innblanding:

Etter informert samtykke, baselineundersøkelse og prøvetaking blir deltakerne tilfeldig fordelt i en av studiegruppene og gitt tilførsel av enten probiotiske tabletter eller placebotabletter.

De probiotiske tablettene inneholder Lactobacillus rhamnosus PB01 og Lactobacillus curvatus P2-2 i en dose på 1 * 109 CFU/tablett. Stammene er valgt basert på in vitro-analyser som undersøker vekstinhibering av patogener og immunmodulering. Placebotablettene er identiske i størrelse og sammensetning, men uten tilsetning av probiotiske stammer. Begge nettbrettene er levert av Bifodan A/S. Deltakerne vil bli bedt om å ta en tablett om morgenen og en om kvelden tretti minutter etter tannpuss. Tablettene er pakket i identiske potter med fargekode. Koden vil bli oppbevart fra etterforskerne til analysen er ferdig.

Deltakerne skal ta to tabletter om dagen i fire uker. Oppfølgingsregistreringer gjennomføres etter to uker, fire uker og seks uker.

Kliniske prosedyrer:

Ved hvert besøk vil spytt og GCF (Gingival Crevicular Fluid) samles og deretter vil plakkindeks (PI) og blødning ved sondering (BOP) bli registrert. For innsamling av GCF vil to kontralaterale bukkale steder fra de øvre fortennene, hjørnetennene eller premolarene bli valgt fra hver deltaker. Visuell supragingival plakk på de valgte tennene vil bli fjernet og stedene vil bli tørket med bomullspellets. GCF vil bli samlet inn ved hjelp av periopaper-strimler (ProFlow, Amityville, NY, USA) forsiktig satt inn i gingival sulcus i 20 s. Plasseringen av stripen er markert på et diagram for å sikre det identiske prøvestedet ved oppfølgingen. Ved blodkontaminering tømmes stripen og prøvetakingen gjentas etter 5 min. Volumet av GCF registreres ved hjelp av en Peritron 8000 (Proflow) og uttrykt i μL. En stripe rommer ca. 0,1-0,4 μL GCF. Strimlene overføres deretter til plastrør og lagres ved -80ºC inntil videre analyse.

For spyttprøvene samles parafinstimulert hel spytt i løpet av en 3-minutters periode minst to timer etter eventuelt matinntak. Den omtrentlige mengden spytt ved normal hastighet vil være 3-6 ml etter 3 minutter. Det oppsamlede spyttet fryses umiddelbart i 1,5 ml alikvoter og lagres ved -80ºC inntil videre analyse. Resten av prøven vil bli destruert etter fullføring av studien.

Laboratorieprosedyrer:

Analyse av cytokiner på GCF: Den absorberte GCF elueres i 120 μL PBS (fosfatbufret saltvann) som inneholder 0,05 % Tween 20. Nivåene av INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 og IL-12 bestemmes ved bruk av luminex og multipleks immunoassaypaneler (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) i samsvar med produsentens håndbok. Konsentrasjonene av cytokinene er uttrykt som pg/ml.

Analyse av spyttmikrobiomet: Totalt bakteriell DNA vil bli ekstrahert fra 2 ml tint spyttprøve for identifikasjon og sammenligning av sammensetningen og stabiliteten til de totale mikrobielle samfunnene i de to forsøksgruppene gjennom amplikonsekvensering av det fylogenetiske markørgenet 16S rRNA. Den hypervariable regionen V3-V4 av bakterielle og arkeale 16S rRNA-gener vil PCR-amplifiseres ved hjelp av spesifikke primere 341F og 806R og analyseres av en etablert sekvenseringspipeline med høy gjennomstrømning utviklet av mikrobiologipartneren fra Københavns Universitet basert på toppmoderne sekvenseringsteknologier (Illumina Mi-Seq) og skreddersydde bioinformatiske verktøy spesielt utviklet for analyse av store mikrobiom-datasett.

Statistiske metoder:

Alle data vil bli behandlet med SPSS-programvare (v 22.0; Chicago, Ill, USA). Oppfølgingsverdiene sammenlignes med baseline innenfor hver gruppe ved Wilcoxon paret tosidig test og forskjeller mellom gruppene analyseres med Wilcoxon uparet test. En p-verdi < 0,05 anses som statistisk signifikant.

Dataledelse:

Alle innsamlede data vil bli behandlet i samsvar med lov om behandling av personopplysninger og «Helseloven». Ved inkludering vil deltakerne bli tildelt et unikt nummer og en egen protokoll uten personnummer.

Vitenskapelig betydning:

Studien kan gi bevis for at de probiotiske tablettene kan påvirke kliniske markører for gingival betennelse og/eller pro- og antiinflammatoriske cytokiner, noe som kan føre til nye strategier for å håndtere gingivitt og opprettholde oral helse. Bruk av probiotiske bakterier i behandling av tannsykdommer kan være et alternativ ved bruk av antibiotika. Videre vil det gi ny innsikt i effekten av å introdusere nye stammer til spyttmikrobiomet som er ment å være en betydelig hendelse i bakterioterapi.

Risikoer og bivirkninger:

Deltakerne er fullt dekket av pasientforsikringen til Tannlegeskolen som dekker eventuelle skader på forsøksdeltakeren under studien. Det er ingen forventede bivirkninger ved behandling med probiotika. Probiotika anses generelt som trygge (GRAS: Generally Recognized As Safe) av European Food Safety Authority (EFSA).

Deltakerne vil bli bedt om å rapportere eventuelle uventede bivirkninger.

Etiske vurderinger:

Deltakerne vil ikke ha direkte nytte av behandlingen, men kunnskapen fra studien kan bidra til å forebygge mikrobielle sykdommer i munnen, f.eks. karies og periodontitt, i fremtiden. Prøvesamlingen forårsaker ikke noe ubehag for deltakerne og tablettene har ingen kjente bivirkninger. Derfor tilsvarer deltakernes personlige fordel minimal risiko og ubehag for deltakerne. Deltakerne som fullfører prøven vil bli kompensert med et gavekort på 500 DKK til Magasin. Det skal presiseres at positive, negative og inkonklusive resultater vil bli publisert.

Tidsplan:

Utarbeidelse av studien vil bli gjennomført vinteren 2014/2015. Etter etisk godkjenning kan pasienter rekrutteres til studien i løpet av vinteren/våren 2015.