Wpływ na tabletki zawierające probiotyczne szczepy kandydujące

Tło:

Ludzka ślina oferuje łatwo dostępną i nieinwazyjną możliwość badania interakcji między bakteriami, a także biomarkerów zdrowia i choroby. Projekt Human Microbiome Project dostarczył informacji, że biofilmy wewnątrz i na zewnątrz naszych ciał ewoluowały razem z ludzkością i odgrywają ważną rolę dla zdrowia. Dotyczy to również jamy ustnej, w której mikrobiom nie odgrywa biernej roli, ale aktywnie przyczynia się do utrzymania zdrowia jamy ustnej. Jednak pewne zmiany ekologiczne w mikrobiomie pozwalają patogenom manifestować się i powodować choroby jamy ustnej. Zgodnie z hipotezą ekologicznej płytki nazębnej, próchnica i zapalenie przyzębia są wynikiem indukowanego przez środowisko nadmiernego wzrostu odpowiednio gatunków kwasotwórczych i proteolitycznych.

Bakterioterapia to termin używany, gdy nieszkodliwy szczep efektorowy jest wszczepiany do mikroflory gospodarza w celu utrzymania lub przywrócenia naturalnego mikrobiomu poprzez ingerencję i/lub hamowanie innych mikroorganizmów, a zwłaszcza patogenów. Może to otworzyć alternatywne sposoby zwalczania chorób zakaźnych z mniej szkodliwymi skutkami ubocznymi, a także może pomóc w leczeniu zaburzeń, które wydają się nie mieć nic wspólnego z bakteriami, takich jak astma, otyłość i cukrzyca. Bakterie probiotyczne, definiowane jako „żywe mikroorganizmy, które podane w odpowiednich ilościach przynoszą korzyści zdrowotne gospodarzowi” (WHO), są powszechnie sugerowanymi kandydatami do bakterioterapii. Potencjalne mechanizmy działania nadal nie są w pełni poznane, ale wydaje się jasne, że istnieją skutki lokalne (bezpośrednie) i systemowe (pośrednie). Według Reida potencjalne możliwości to: i) koagregacja z patogenami i zahamowanie wzrostu, ii) produkcja bakteriocyny i nadtlenku wodoru, iii) konkurencyjne wykluczenie poprzez antagonistyczne działania na miejsca adhezji i odżywianie, iv) układowa immunomodulacja.

Badania in vitro wykazały wpływ na koagregację i hamowanie wzrostu, a badania kliniczne wykazały wpływ na parametry kliniczne zapalenia dziąseł, ale nadal niewiele wiadomo na temat efektu immunomodulacyjnego i interakcji gospodarz-drobnoustroj.

Choroby przyzębia należą do najbardziej rozpowszechnionych chorób zakaźnych u człowieka i mogą prowadzić do utraty zębów. Nieleczone zapalenie dziąseł może prowadzić do zapalenia przyzębia.

Różne powierzchnie jamy ustnej są stale skąpane w ślinie, a kilka patogennych gatunków w ślinie jest związanych z chorobami przyzębia. Badania mikrobiologicznego wpływu bakterii probiotycznych na zdrowie jamy ustnej opierały się dotychczas na konwencjonalnych metodach hodowli i koncentrowały się na jednym lub kilku szczepach. Nowe techniki o dużej przepustowości dają możliwość uzyskania bardziej wszechstronnego i precyzyjnego obrazu profili bakteryjnych, jednak dotychczas tylko w kilku badaniach wykorzystano sekwencjonowanie do określenia składu bakteryjnego śliny po spożyciu bakterii probiotycznych. Większość analizuje skład po bardzo krótkim okresie przyjmowania bakterii probiotycznych. Dlatego istnieje tylko jedno badanie, w którym przeanalizowano skład po dłuższym okresie interwencji i skorelowano to z wynikami klinicznymi.

Cel:

Celem pracy jest zbadanie wpływu tabletek zawierających kandydujące szczepy probiotyczne na zapalenie dziąseł oraz poziom wybranych cytokin pro- i przeciwzapalnych w płynie dziąsłowym (GCF). Celem drugorzędnym jest opisanie wpływu tabletek na mikrobiom śliny. Hipoteza zerowa jest taka, że ​​pomiary kliniczne, poziomy cytokin i skład mikrobiologiczny śliny nie będą się różnić od wartości wyjściowych ani między grupą badaną a grupą kontrolną.

Projekt badania:

Badanie zaplanowano jako podwójnie ślepą próbę; randomizowane badanie kontrolowane placebo z dwoma równoległymi ramionami. Planowany okres interwencji to 4 tygodnie. Plan badania zostanie przedstawiony do zatwierdzenia etycznego.

Materiał:

Uczestnicy będą rekrutowani spośród pacjentów kliniki w School of Dentistry oraz poprzez stronę www.forsogsperson.dk. Planuje się, że 80 uczestników zostanie zapisanych po wyrażeniu świadomej zgody, a następnie losowo przydzielonych do grupy probiotycznej lub grupy placebo. Liczebność próby określono za pomocą analizy potęgowej (α=0,05 i β=0,2) na podstawie uzyskanych wcześniej wartości BOP. Potrzebnych jest siedemdziesięciu czterech uczestników, a zapisanych jest 80, aby zrekompensować oczekiwane odpady.

Rekrutacja: Jeśli uczestnicy po zapoznaniu się z ogłoszeniem o badaniu wyrażą zainteresowanie badaniem, zostaną zaproszeni na spotkanie informacyjne z adiunktem i dentystą Mette Kirstine Keller. Przed spotkaniem uczestnicy zostaną poinformowani, że mają prawo przyjść na spotkanie informacyjne z osobą towarzyszącą. Otrzymają również pisemną informację o badaniu. Spotkanie odbędzie się w sali konferencyjnej bez innych osób oprócz badacza, uczestnika i ewentualnie osoby towarzyszącej. Informacje ustne będą oparte na informacjach pisemnych i zostaną podane prostym językiem, bez wartościowych sformułowań. Badacz jest odpowiedzialny za upewnienie się, że uczestnik zrozumiał wszystkie podane informacje przed rozpoczęciem projektu. Wszystkie uwagi uczestnika są brane pod uwagę zarówno podczas wywiadu informacyjnego, jak i badania. W każdej chwili uczestnik może wycofać się z projektu. Świadoma zgoda na udział w badaniu udzielana jest na podstawie informacji ustnych i pisemnych, a zgoda taka może być wyrażona po co najmniej 24-godzinnym namyśle. Projekt nie obejmuje osób, które z powodu niepełnosprawności fizycznej lub umysłowej nie mogą wyrazić świadomej zgody.

Metody:

Interwencja:

Po uzyskaniu świadomej zgody, badaniu wyjściowym i pobraniu próbek, uczestnicy są losowo przydzielani do jednej z grup badawczych i otrzymują zapas tabletek probiotycznych lub tabletek placebo.

Tabletki probiotyczne zawierają Lactobacillus rhamnosus PB01 i Lactobacillus curvatus P2-2 w dawce 1*109 CFU/tabletkę. Szczepy dobierane są na podstawie testów in vitro badających hamowanie wzrostu patogenów i immunomodulację. Tabletki placebo są identyczne pod względem wielkości i składu, ale bez dodatku szczepów probiotycznych. Obie tabletki są dostarczane przez Bifodan A/S. Uczestnicy zostaną poinstruowani, aby przyjmować jedną tabletkę rano i jedną wieczorem trzydzieści minut po umyciu zębów. Tabletki pakowane są w identyczne pojemniczki z kodowaniem kolorystycznym. Kod nie będzie dostępny dla badaczy do czasu zakończenia analizy.

Uczestnicy będą przyjmować dwie tabletki dziennie przez cztery tygodnie. Rejestracje uzupełniające są przeprowadzane po dwóch tygodniach, czterech tygodniach i sześciu tygodniach.

Procedury kliniczne:

Podczas każdej wizyty zostanie pobrana ślina i GCF (płyn dziąsłowy), a następnie zarejestrowany zostanie wskaźnik płytki nazębnej (PI) i krwawienie podczas sondowania (BOP). Do pobrania GCF od każdego uczestnika zostaną wybrane dwa przeciwległe miejsca policzkowe z górnych siekaczy, kłów lub zębów przedtrzonowych. Wizualna naddziąsłowa płytka nazębna na wybranych zębach zostanie usunięta, a miejsca zostaną wysuszone za pomocą wacików. GCF zostanie pobrany za pomocą pasków periopapieru (ProFlow, Amityville, NY, USA) delikatnie włożonych w bruzdę dziąsłową na 20 sekund. Pozycja paska jest zaznaczona na wykresie, aby zabezpieczyć identyczne miejsce pobrania próbki podczas wizyt kontrolnych. W przypadku zanieczyszczenia krwią pasek jest rozładowywany i po 5 min pobieranie próbki jest powtarzane. Objętość GCF rejestruje się przy użyciu Peritron 8000 (Proflow) i wyraża w μl. Jeden pasek zawiera około 0,1-0,4 μl GCF. Paski są następnie przenoszone do plastikowych probówek i przechowywane w temperaturze -80ºC do czasu dalszej analizy.

W przypadku próbek śliny pobiera się ślinę pełną stymulowaną parafiną w ciągu 3 minut, co najmniej dwie godziny po każdym spożyciu pokarmu. Przybliżona ilość śliny przy normalnej szybkości wyniesie 3-6 ml po 3 minutach. Pobraną ślinę natychmiast zamraża się w porcjach po 1,5 ml i przechowuje w -80ºC do dalszej analizy. Pozostała część próbki zostanie zniszczona po zakończeniu badania.

Procedury laboratoryjne:

Analiza cytokin na GCF: Zaabsorbowany GCF eluuje się w 120 μl PBS (solanka buforowana fosforanami) zawierającej 0,05% Tween 20. Poziomy INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 i IL-12 określa się za pomocą paneli immunologicznych luminex i multiplex (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Stężenia cytokin wyrażono jako pg/ml.

Analiza mikrobiomu śliny: Całkowity bakteryjny DNA zostanie wyekstrahowany z 2 ml rozmrożonej próbki śliny w celu identyfikacji i porównania składu i stabilności wszystkich społeczności drobnoustrojów w dwóch grupach próbnych poprzez sekwencjonowanie amplikonu filogenetycznego genu markerowego 16S rRNA. Region hiperzmienny V3-V4 bakteryjnych i archeologicznych genów 16S rRNA zostanie zamplifikowany metodą PCR przy użyciu specyficznych starterów 341F i 806R i przeanalizowany za pomocą wysokowydajnego procesu sekwencjonowania opracowanego przez partnera z Uniwersytetu w Kopenhadze w dziedzinie mikrobiologii w oparciu o najnowocześniejsze technologie sekwencjonowania (Illumina Mi-Seq) oraz niestandardowe narzędzia bioinformatyczne zaprojektowane specjalnie do analizy dużych zbiorów danych mikrobiomu.

Metody statystyczne:

Wszystkie dane będą przetwarzane za pomocą oprogramowania SPSS (wersja 22.0; Chicago, Illinois, USA). Wartości kontrolne porównuje się z wartościami wyjściowymi w każdej grupie za pomocą dwustronnego testu par Wilcoxona, a różnice między grupami analizuje się za pomocą testu niesparowanych Wilcoxona. Wartość p < 0,05 uważa się za istotną statystycznie.

Zarządzanie danymi:

Wszystkie zebrane dane będą przetwarzane zgodnie z ustawą o przetwarzaniu danych osobowych i „Prawem zdrowotnym”. Przy włączeniu uczestnicy otrzymają unikalny numer oraz odrębny protokół bez osobistego numeru identyfikacyjnego.

Znaczenie naukowe:

Badanie może dostarczyć dowodów na to, że tabletki probiotyczne mogą wpływać na kliniczne markery zapalenia dziąseł i/lub cytokiny pro- i przeciwzapalne, co może prowadzić do nowych strategii leczenia zapalenia dziąseł i utrzymania zdrowia jamy ustnej. Wykorzystanie bakterii probiotycznych w leczeniu chorób przyzębia może być jedną z opcji stosowania antybiotyków. Ponadto dostarczy nowych informacji na temat wpływu wprowadzenia nowych szczepów do mikrobiomu śliny, co ma być znaczącym wydarzeniem w bakterioterapii.

Zagrożenia i skutki uboczne:

Uczestnicy są w pełni objęci ubezpieczeniem Pacjenta Szkoły Stomatologii, które pokrywa wszelkie szkody wyrządzone uczestnikowi badania podczas badania. Nie przewiduje się skutków ubocznych kuracji probiotykami. Probiotyki są ogólnie uważane za bezpieczne (GRAS: General Recognized As Safe) przez Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA).

Uczestnicy zostaną poproszeni o zgłaszanie wszelkich nieoczekiwanych działań niepożądanych.

Względy etyczne:

Uczestnicy nie odniosą bezpośrednich korzyści z leczenia, ale wiedza zdobyta podczas badania może przyczynić się do zapobiegania chorobom jamy ustnej pochodzenia bakteryjnego, m.in. próchnicę i zapalenie przyzębia w przyszłości. Pobieranie próbek nie powoduje dyskomfortu u uczestników, a tabletki nie mają znanych skutków ubocznych. W związku z tym osobista korzyść uczestników odpowiada minimalnemu ryzyku i dyskomfortowi uczestników. Uczestnicy, którzy ukończą okres próbny, otrzymają w ramach rekompensaty bon podarunkowy o wartości 500 DKK do firmy Magasin. Należy podkreślić, że publikowane będą wyniki pozytywne, negatywne i niejednoznaczne.

Harmonogram:

Przygotowanie studium będzie realizowane w okresie zimowym 2014/2015. Po zatwierdzeniu etycznym pacjentów można rekrutować do badania zimą/wiosną 2015 r.