对含有益生菌候选菌株的片剂的影响

背景：

人类唾液提供了一种易于获取且非侵入性的机会来研究细菌相互作用以及健康和疾病的生物标志物。 人类微生物组计划提供的见解表明，我们身体内外的生物膜与人类共同进化，对健康起着重要作用。 对于口腔也是如此，微生物群在口腔中不是扮演被动角色，而是积极促进口腔健康的维持。 然而，微生物组中的某些生态变化允许病原体出现并引起口腔疾病。 根据生态菌斑假说，龋齿和牙周炎分别是环境诱导的酸性物质和蛋白水解物过度生长的结果。

细菌疗法是指将无害效应菌株植入宿主的微生物群，通过干扰和/或抑制其他微生物（尤其是病原体）来维持或恢复天然微生物群。 这可能会开辟对抗传染病的替代方法，而且副作用较小，还可能有助于治疗似乎与细菌无关的疾病，如哮喘、肥胖症和糖尿病。 益生菌被定义为“活的微生物，当给予足够的量时，会给宿主带来健康益处”(WHO)，通常被建议用于细菌疗法。 潜在的作用机制仍未完全了解，但似乎很明显存在局部（直接）和全身（间接）影响。 根据 Reid 的说法，潜在的途径是：i）与病原体共聚集和生长抑制，ii）细菌素和过氧化氢产生，iii）通过对粘附位点和营养的拮抗活动进行竞争排斥，iv）全身免疫调节。

体外研究表明对共聚集和生长抑制有影响，临床研究表明对牙龈炎症的临床参数有影响，但对免疫调节作用和宿主-微生物相互作用知之甚少。

牙周病是人类最普遍的传染病之一，可导致牙齿脱落。 如果不及时治疗牙龈炎会导致牙周炎。

口腔的不同表面都不断沐浴在唾液中，唾液中的几种致病菌与牙周病有关。 迄今为止，关于益生菌对口腔健康的微生物效应的研究都是基于常规的培养方法，并集中在一种或几种菌株上。 新的高通量技术为更全面、更精确地描绘细菌概况提供了可能性，但迄今为止，只有少数研究使用测序来确定摄入益生菌后唾液中的细菌组成。 大多数分析是在非常短期摄入益生菌后进行的。 因此，只有一项研究分析了较长干预期后的成分并将其与临床结果相关联。

目的：

该研究的目的是研究含有益生菌候选菌株的片剂对牙龈炎症的影响以及龈沟液 (GCF) 中选定的促炎和抗炎细胞因子水平。 第二个目的是描述药片对唾液微生物组的影响。 零假设是唾液的临床测量值、细胞因子水平和微生物组成与基线或研究组与对照组之间没有差异。

学习规划：

该研究计划为双盲；有两个平行臂的安慰剂对照随机试验。 干预期计划为4周。 研究计划将提交伦理批准。

材料：

参与者将在牙科学院诊所的患者中招募，并通过 www.forsogsperson.dk 招募。 计划在知情同意后招募 80 名参与者，然后随机分配到益生菌组或安慰剂组。 基于先前获得的 BOP 值，通过功效分析（α= 0.05 和 β=0.2）确定样本大小。 需要 74 名参与者，并招募了 80 名参与者，以补偿预期的退出人数。

招募：如果参与者在阅读有关研究的通知后表示对研究感兴趣，他们将被邀请与助理教授和牙医 Mette Kirstine Keller 进行信息预约。 在预约之前，与会者将被告知他们有权带一名同伴参加说明会。 他们还将收到有关该研究的书面信息。 约会将在会议室进行，除调查员、参与者和可能的同伴外，没有其他人在场。 口头信息将以书面信息为基础，并以通俗易懂的语言提供，没有任何有价值的条款。 调查员负责确保参与者在项目开始前理解所有给定的信息。 在信息访谈和研究期间，参与者的所有评论都会被相关考虑。 参与者可以随时退出项目。 参与试验的知情同意是在口头和书面信息的基础上给出的，这种同意可以在至少 24 小时的思考时间后给出。 该项目不包括因身体或精神障碍而无法给予知情同意的受试者。

方法：

干涉：

在知情同意、基线检查和抽样之后，参与者被随机分配到其中一个研究组，并提供益生菌片或安慰剂片。

益生菌片含有鼠李糖乳杆菌 PB01 和弯曲乳杆菌 P2-2，剂量为 1 * 109 CFU/片。 菌株的选择基于研究病原体生长抑制和免疫调节的体外试验。 安慰剂片剂的大小和成分相同，但未添加益生菌菌株。 两种药片均由 Bifodan A/S 提供。 将指示参与者在刷牙后三十分钟早上服用一粒，晚上服用一粒。 药片包装在带有颜色编码的相同罐中。 在分析完成之前，代码将对调查人员保密。

参与者将每天服用两片药片，持续四个星期。 两周、四周和六周后进行后续登记。

临床程序：

每次就诊时，将收集唾液和 GCF（牙龈沟液），然后记录菌斑指数 (PI) 和探诊出血 (BOP)。 对于 GCF 的收集，将从每个参与者中选择上切牙、尖牙或前磨牙的两个对侧颊侧部位。 所选牙齿上可见的龈上牙菌斑将被去除，该部位将用棉球擦干。 GCF 将使用牙周纸条（ProFlow，Amityville，NY，USA）轻轻插入牙龈沟中 20 秒来收集。 条带的位置标记在图表上，以确保后续的采样点相同。 在血液污染的情况下，取出条带并在 5 分钟后重复取样。 GCF 的体积使用 Peritron 8000 (Proflow) 记录并以 μL 表示。 一根试纸条可容纳约 0.1-0.4 μL GCF。 然后将条带转移到塑料管中并储存在 -80ºC 直至进一步分析。

对于唾液样本，在摄入任何食物后至少两小时内，在 3 分钟内收集石蜡刺激的全唾液。 3 分钟后，正常速度下的唾液量约为 3-6 毫升。 收集到的唾液立即以 1.5 ml 等分试样冷冻，并储存在 -80ºC 直至进一步分析。 剩余的样本将在研究完成后销毁。

实验室程序：

GCF 上细胞因子的分析：吸收的 GCF 在含有 0.05% Tween 20 的 120 μL PBS（磷酸盐缓冲盐水）中洗脱。 INFγ、TNF-α、IL-8、IL-10 和 IL-12 的水平根据制造商的手册使用 luminex 和多重免疫测定面板（LINCOplex，LINCO Research，Inc，USA）测定。 细胞因子的浓度表示为 pg/ml。

唾液微生物组分析：从2ml解冻的唾液样本中提取总细菌DNA，通过系统发育标记基因16S rRNA的扩增子测序，鉴定和比较两个试验组总微生物群落的组成和稳定性。 细菌和古细菌 16S rRNA 基因的高变区 V3-V4 将使用特异性引物 341F 和 806R 进行 PCR 扩增，并通过哥本哈根大学微生物学合作伙伴基于最先进技术开发的既定高通量测序流程进行分析测序技术 (Illumina Mi-Seq) 和专门为分析大型微生物组数据集而设计的定制生物信息学工具。

统计方法：

所有数据都将使用 SPSS 软件（v 22.0；芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行处理。 通过 Wilcoxon 配对双侧检验将随访值与每组内的基线进行比较，并通过 Wilcoxon 非配对检验分析组间差异。 p 值 < 0.05 被认为具有统计显着性。

数据管理：

所有收集的数据将按照《个人数据处理法》和《卫生法》进行处理。 在包含时，参与者将被分配一个唯一的号码和一个没有个人识别号码的单独协议。

科学重要性：

该研究可能提供证据表明益生菌片剂可以影响牙龈炎症和/或促炎和抗炎细胞因子的临床标志物，这可以导致治疗牙龈炎和维持口腔健康的新策略。 使用益生菌治疗牙科疾病可能是使用抗生素的一种选择。 此外，它将为将新菌株引入唾液微生物组的效果提供新的见解，这被认为是细菌疗法中的一个重要事件。

风险和不利影响：

参与者完全由牙科学院的患者保险承保，该保险涵盖研究期间对试验参与者造成的任何损害。益生菌治疗没有预期的副作用。 益生菌通常被欧洲食品安全局 (EFSA) 认为是安全的（GRAS：公认安全）。

参与者将被要求报告任何意外的不利影响。

道德考量：

参与者不会直接从治疗中受益，但从研究中获得的知识可能有助于预防口腔微生物引起的疾病，例如口腔疾病。 龋齿和牙周炎，在未来。 样本采集不会对参与者造成任何不适，而且药片也没有已知的副作用。 因此，参与者的个人利益对应于参与者的最小风险和不适。 完成试用的参与者将获得 Magasin 的 500 丹麦克朗礼券作为补偿。 应该强调的是，将公布正面、负面和不确定的结果。

时间表：

研究准备工作将于 2014/2015 年冬季进行。 伦理批准后，患者可以在 2015 年冬季/春季期间被招募到研究中。