Efectos sobre tabletas que contienen cepas candidatas a probióticos

Fondo:

La saliva humana ofrece una oportunidad no invasiva y de fácil acceso para estudiar las interacciones bacterianas, así como los biomarcadores de salud y enfermedad. El Proyecto del Microbioma Humano ha proporcionado información de que las biopelículas dentro y fuera de nuestros cuerpos han evolucionado junto con la humanidad y juegan un papel importante para la salud. Esto también es cierto para la cavidad bucal en la que la microbiota no juega un papel pasivo sino que contribuye activamente al mantenimiento de la salud bucal. Sin embargo, ciertos cambios ecológicos en el microbioma permiten que los patógenos se manifiesten y causen enfermedades orales. De acuerdo con la hipótesis de la placa ecológica, la caries y la periodontitis son el resultado del crecimiento excesivo de especies acidúricas y proteolíticas inducidas por el medio ambiente, respectivamente.

Bacterioterapia es el término utilizado cuando se implanta una cepa efectora inofensiva en la microflora del huésped para mantener o restaurar un microbioma natural mediante la interferencia y/o la inhibición de otros microorganismos, y especialmente patógenos. Esto podría abrir caminos alternativos para combatir enfermedades infecciosas con efectos secundarios menos dañinos y también podría ayudar en el tratamiento de trastornos que parecen no tener nada que ver con las bacterias, como el asma, la obesidad y la diabetes. Las bacterias probióticas, definidas como "microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio para la salud del huésped" (OMS), son candidatas comúnmente sugeridas para la bacterioterapia. Los posibles mecanismos de acción aún no se comprenden por completo, pero parece claro que existen efectos locales (directos) y sistémicos (indirectos). Según Reid, las vías potenciales son: i) coagregación con patógenos e inhibición del crecimiento, ii) producción de bacteriocina y peróxido de hidrógeno, iii) exclusión competitiva a través de actividades antagónicas en los sitios de adhesión y nutrición, iv) inmunomodulación sistémica.

Los estudios in vitro han demostrado un efecto sobre la coagregación y la inhibición del crecimiento y los estudios clínicos han demostrado un efecto sobre los parámetros clínicos de la inflamación gingival, pero aún se sabe poco sobre el efecto inmunomodulador y la interacción huésped-microbio.

Las enfermedades periodontales se encuentran entre las enfermedades infecciosas más extendidas en el hombre y pueden conducir a la pérdida de dientes. Si no se trata, la gingivitis puede provocar periodontitis.

Las diferentes superficies de la cavidad oral están continuamente bañadas en saliva y varias especies patógenas en la saliva se han asociado con la enfermedad periodontal. Hasta ahora, los estudios sobre el efecto microbiano de las bacterias probióticas en la salud bucal se han basado en métodos de cultivo convencionales y se han centrado en una o unas pocas cepas. Las nuevas técnicas de alto rendimiento brindan la posibilidad de una imagen más completa y precisa de los perfiles bacterianos, pero hasta la fecha solo unos pocos estudios han utilizado la secuenciación para determinar la composición bacteriana de la saliva después de la ingesta de bacterias probióticas. La mayoría analiza la composición después de una ingesta a muy corto plazo de bacterias probióticas. Por lo tanto, solo hay un estudio que analizó la composición después de un período de intervención más largo y lo correlacionó con los resultados clínicos.

Apuntar:

El objetivo del estudio es investigar el efecto de las tabletas que contienen cepas probióticas candidatas sobre la inflamación gingival y los niveles de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias seleccionadas en el líquido crevicular gingival (GCF). Un objetivo secundario es describir el efecto de las tabletas en el microbioma salival. La hipótesis nula es que las mediciones clínicas, los niveles de citoquinas y la composición microbiana de la saliva no diferirán de la línea de base o entre el estudio y el grupo de control.

Diseño del estudio:

El estudio está planificado como doble ciego; ensayo aleatorizado controlado con placebo con dos brazos paralelos. El período de intervención está previsto que sea de 4 semanas. El plan de estudios será sometido a aprobación ética.

Material:

Los participantes serán reclutados entre los pacientes de la clínica de la Facultad de Odontología ya través de www.forsogsperson.dk. Se planea inscribir a 80 participantes después del consentimiento informado y luego asignarlos aleatoriamente al grupo de probióticos o al grupo de placebo. El tamaño de la muestra se determinó mediante un análisis de potencia (α= 0,05 y β=0,2) con base en los valores de BOP obtenidos previamente. Se necesitan 74 participantes y se inscriben 80 para compensar las deserciones previstas.

Reclutamiento: Si los participantes después de leer el aviso sobre el estudio expresan interés en el estudio, serán invitados a una cita informativa con la profesora asistente y dentista Mette Kirstine Keller. Previamente a la cita, se informará a los participantes que tienen derecho a traer un acompañante a la reunión informativa. También recibirán la información escrita sobre el estudio. La cita tendrá lugar en una sala de reuniones sin más personas presentes que el investigador, el participante y, posiblemente, un acompañante. La información oral se basará en la información escrita y se dará en un lenguaje sencillo sin términos cargados de valor. El investigador es responsable de asegurarse de que el participante haya entendido toda la información proporcionada antes de que comience el proyecto. Todos los comentarios del participante se toman en consideración tanto durante la entrevista informativa como durante el estudio. En cualquier momento el participante puede retirarse del proyecto. El consentimiento informado para la participación en el ensayo se otorga sobre la base de información oral y escrita, y dicho consentimiento puede otorgarse después de al menos 24 horas de tiempo de reflexión. El proyecto no incluye sujetos que, por discapacidad física o psíquica, no puedan dar el consentimiento informado.

Métodos:

Intervención:

Después del consentimiento informado, el examen inicial y el muestreo, los participantes se asignan aleatoriamente a uno de los grupos de estudio y se les suministra tabletas de probióticos o tabletas de placebo.

Las tabletas probióticas contienen Lactobacillus rhamnosus PB01 y Lactobacillus curvatus P2-2 a una dosis de 1 * 109 UFC/tableta. Las cepas se eligen en base a ensayos in vitro que investigan la inhibición del crecimiento de patógenos y la inmunomodulación. Las tabletas de placebo son idénticas en tamaño y composición pero sin la adición de las cepas probióticas. Ambas tabletas son proporcionadas por Bifodan A/S. Se indicará a los participantes que tomen un comprimido por la mañana y otro por la noche treinta minutos después de cepillarse los dientes. Los comprimidos se envasan en botes idénticos con código de colores. El código se mantendrá oculto a los investigadores hasta que finalice el análisis.

Los participantes tomarán dos tabletas al día durante cuatro semanas. Los registros de seguimiento se realizan después de dos semanas, cuatro semanas y seis semanas.

Procedimientos clínicos:

En cada visita, se recolectará saliva y GCF (Gingival Crevicular Fluid) y luego se registrará el índice de placa (PI) y el sangrado al sondaje (BOP). Para la recolección de GCF, se seleccionarán dos sitios bucales contralaterales de los incisivos, caninos o premolares superiores de cada participante. Se eliminará la placa supragingival visual en los dientes seleccionados y los sitios se secarán con bolitas de algodón. El GCF se recolectará usando tiras de papel perio (ProFlow, Amityville, NY, EE. UU.) insertadas suavemente en el surco gingival durante 20 s. La posición de la tira se marca en un gráfico para asegurar el sitio de muestra idéntico en los seguimientos. En caso de contaminación con sangre, la tira se descarga y el muestreo se repite después de 5 min. El volumen de GCF se registra usando un Peritron 8000 (Proflow) y se expresa en μL. Una tira contiene aproximadamente 0,1-0,4 μL GCF. A continuación, las tiras se transfieren a tubos de plástico y se almacenan a -80 ºC hasta su posterior análisis.

Para las muestras de saliva, la saliva entera estimulada con parafina se recolecta durante un período de 3 minutos al menos dos horas después de la ingesta de alimentos. La cantidad aproximada de saliva a un ritmo normal será de 3-6 ml después de 3 minutos. La saliva recogida se congela inmediatamente en alícuotas de 1,5 ml y se almacena a -80ºC hasta su posterior análisis. El resto de la muestra se destruirá una vez finalizado el estudio.

Procedimientos de laboratorio:

Análisis de citoquinas en GCF: El GCF absorbido se eluye en 120 μL de PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contiene Tween 20 al 0,05 %. Los niveles de INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 e IL-12 se determinan utilizando paneles de inmunoensayo luminex y multiplex (LINCOplex, LINCO Research, Inc, EE. UU.) de acuerdo con el manual del fabricante. Las concentraciones de las citocinas se expresan en pg/ml.

Análisis del microbioma salival: el ADN bacteriano total se extraerá de 2 ml de muestra de saliva descongelada para identificar y comparar la composición y la estabilidad de las comunidades microbianas totales en los dos grupos de prueba mediante la secuenciación de amplicón del gen marcador filogenético 16S rRNA. La región hipervariable V3-V4 de los genes del ARNr 16S de bacterias y arqueas se amplificará por PCR usando los cebadores específicos 341F y 806R y se analizará mediante un proceso de secuenciación de alto rendimiento establecido desarrollado por el socio de Microbiología de la Universidad de Copenhague basado en tecnología de punta. tecnologías de secuenciación (Illumina Mi-Seq) y herramientas bioinformáticas personalizadas diseñadas específicamente para el análisis de grandes conjuntos de datos de microbiomas.

Métodos de estadística:

Todos los datos se procesarán con el software SPSS (v 22.0; Chicago, Ill, EE. UU.). Los valores de seguimiento se comparan con los valores basales dentro de cada grupo mediante la prueba bilateral pareada de Wilcoxon y las diferencias entre los grupos se analizan mediante la prueba no pareada de Wilcoxon. Un valor de p < 0,05 se considera estadísticamente significativo.

Gestión de datos:

Todos los datos recopilados serán tratados de conformidad con la Ley de Tratamiento de Datos Personales y "La Ley de Salud". Al momento de la inclusión, a los participantes se les asignará un número único y un protocolo separado sin número de identificación personal.

Importancia científica:

El estudio puede proporcionar evidencia de que las tabletas de probióticos pueden influir en los marcadores clínicos de inflamación gingival y/o citocinas pro y antiinflamatorias, lo que puede conducir a nuevas estrategias para controlar la gingivitis y mantener la salud bucal. El uso de bacterias probióticas en el tratamiento de enfermedades dentales podría ser una opción al uso de antibióticos. Además, proporcionará nuevos conocimientos sobre el efecto de introducir nuevas cepas en el microbioma salival, lo que se supone que es un evento significativo en la bacterioterapia.

Riesgos y efectos adversos:

Los participantes están completamente cubiertos por el seguro del paciente de la Facultad de Odontología que cubre cualquier daño al participante del ensayo durante el estudio. No se esperan efectos secundarios del tratamiento con probióticos. Los probióticos generalmente se consideran seguros (GRAS: Generalmente reconocidos como seguros) por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA).

Se pedirá a los participantes que informen cualquier efecto adverso inesperado.

Consideraciones éticas:

Los participantes no se beneficiarán directamente del tratamiento, pero el conocimiento obtenido del estudio podría contribuir a la prevención de enfermedades derivadas de microbios en la boca, p. caries y periodontitis, en el futuro. La recogida de muestras no provoca ninguna molestia a los participantes y los comprimidos no tienen efectos secundarios conocidos. Por lo tanto, el beneficio personal de los participantes corresponde al mínimo riesgo e incomodidad para los participantes. Los participantes que completen la prueba serán compensados ​​con un vale regalo de 500 DKK para Magasin. Cabe recalcar que se publicarán resultados positivos, negativos y no concluyentes.

Horario:

La preparación del estudio se llevará a cabo en el invierno 2014/2015. Después de la aprobación ética, los pacientes pueden ser reclutados para el estudio durante el invierno/primavera de 2015.