Воздействие на таблетки, содержащие пробиотические штаммы-кандидаты

Фон:

Человеческая слюна предлагает легкодоступную и неинвазивную возможность для изучения бактериальных взаимодействий, а также биомаркеров здоровья и болезней. Проект микробиома человека позволил понять, что биопленки внутри и снаружи нашего тела эволюционировали вместе с человечеством и играют важную роль для здоровья. Это также верно для полости рта, в которой микробиота не играет пассивной роли, а активно способствует поддержанию здоровья полости рта. Однако определенные экологические сдвиги в микробиоме позволяют патогенам проявляться и вызывать заболевания полости рта. Согласно гипотезе экологического налета, кариес и периодонтит являются результатом индуцированного окружающей средой чрезмерного роста ацидурических и протеолитических видов соответственно.

Бактериотерапия — это термин, используемый, когда безвредный эффекторный штамм имплантируется в микрофлору хозяина для поддержания или восстановления естественного микробиома путем вмешательства и/или ингибирования других микроорганизмов, особенно патогенов. Это может открыть альтернативные способы борьбы с инфекционными заболеваниями с менее вредными побочными эффектами, а также может помочь в лечении заболеваний, которые, кажется, не имеют ничего общего с бактериями, таких как астма, ожирение и диабет. Пробиотические бактерии, определяемые как «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью хозяина» (ВОЗ), обычно являются кандидатами для бактериотерапии. Потенциальные механизмы действия до сих пор полностью не изучены, но кажется очевидным, что существуют как местные (прямые), так и системные (косвенные) эффекты. Согласно Reid, потенциальными путями являются: i) коагрегация с патогенами и ингибирование роста, ii) продукция бактериоцина и перекиси водорода, iii) конкурентное исключение посредством антагонистической активности в местах адгезии и питания, iv) системная иммуномодуляция.

Исследования in vitro показали влияние на коагрегацию и ингибирование роста, а клинические исследования показали влияние на клинические параметры воспаления десен, но до сих пор мало что известно об иммуномодулирующем действии и взаимодействии хозяин-микроб.

Заболевания пародонта относятся к наиболее распространенным инфекционным заболеваниям человека и могут приводить к потере зубов. При отсутствии лечения гингивит может привести к пародонтиту.

Различные поверхности ротовой полости постоянно омываются слюной, и несколько патогенных видов в слюне связаны с пародонтозом. Исследования микробного воздействия пробиотических бактерий на здоровье полости рта до сих пор основывались на традиционных методах культивирования и были сосредоточены на одном или нескольких штаммах. Новые высокопроизводительные методы дают возможность получить более полную и точную картину бактериального профиля, но на сегодняшний день только в нескольких исследованиях использовалось секвенирование для определения бактериального состава слюны после приема пробиотических бактерий. Большинство анализируют состав после очень короткого приема пробиотических бактерий. Таким образом, существует только одно исследование, в котором анализировали состав препарата после более длительного периода вмешательства и сопоставляли его с клиническими результатами.

Цель:

Целью исследования является изучение влияния таблеток, содержащих пробиотические штаммы-кандидаты, на воспаление десен и уровни отдельных про- и противовоспалительных цитокинов в жидкости десневой борозды (GCF). Вторая цель — описать влияние таблеток на микробиом слюны. Нулевая гипотеза состоит в том, что клинические показатели, уровни цитокинов и микробный состав слюны не будут отличаться от исходных или между исследуемой и контрольной группой.

Дизайн исследования:

Исследование планируется как двойное слепое; плацебо-контролируемое рандомизированное исследование с двумя параллельными группами. Период вмешательства запланирован на 4 недели. План исследования будет представлен на этическое одобрение.

Материал:

Участники будут набираться среди пациентов клиники при Школе стоматологии и через сайт www.forsogsperson.dk. Планируется, что 80 участников будут зарегистрированы после информированного согласия, а затем случайным образом распределены либо в группу пробиотиков, либо в группу плацебо. Размер выборки определялся анализом мощности (α = 0,05 и β = 0,2) на основе значений BOP, полученных ранее. Необходимо 74 участника и 80 зарегистрированы, чтобы компенсировать ожидаемый отсев.

Набор участников: если участники после прочтения уведомления об исследовании проявят интерес к исследованию, они будут приглашены на информационную встречу с доцентом и стоматологом Метте Кирстин Келлер. До встречи участники будут проинформированы о том, что они имеют право привести на информационную встречу сопровождающего. Они также получат письменную информацию об исследовании. Встреча будет проходить в комнате для совещаний без присутствия других лиц, кроме следователя, участника и, возможно, сопровождающего. Устная информация будет основываться на письменной информации и будет даваться простым языком без каких-либо ценностных терминов. Исследователь несет ответственность за то, чтобы участник понял всю предоставленную информацию до начала проекта. Все комментарии участника принимаются во внимание как во время информационного интервью, так и во время исследования. В любой момент участник может выйти из проекта. Информированное согласие на участие в исследовании дается на основании устной и письменной информации, и такое согласие может быть дано не менее чем через 24 часа на размышление. В проект не входят субъекты, которые из-за физических или психических недостатков не могут дать информированное согласие.

Методы:

Вмешательство:

После получения информированного согласия, исходного обследования и отбора проб участников случайным образом распределяют в одну из групп исследования и выдают либо таблетки с пробиотиками, либо таблетки плацебо.

Пробиотические таблетки содержат Lactobacillus rhamnosus PB01 и Lactobacillus curvatus P2-2 в дозе 1 * 109 КОЕ/таблетка. Штаммы выбирают на основе анализов in vitro, исследующих ингибирование роста патогенов и иммуномодуляцию. Таблетки плацебо идентичны по размеру и составу, но без добавления пробиотических штаммов. Обе таблетки предоставлены Bifodan A/S. Участникам будет предложено принимать одну таблетку утром и одну вечером через тридцать минут после чистки зубов. Таблетки упакованы в одинаковые баночки с цветовой маркировкой. Код будет скрыт от следователей до завершения анализа.

Участники будут принимать по две таблетки в день в течение четырех недель. Последующие регистрации проводятся через две недели, четыре недели и шесть недель.

Клинические процедуры:

При каждом посещении будут собирать слюну и GCF (жидкость десневой борозды), а затем регистрировать индекс зубного налета (PI)) и кровотечение при зондировании (BOP). Для сбора GCF у каждого участника будут выбраны два контралатеральных щечных участка верхних резцов, клыков или премоляров. Визуальный наддесневой налет на выбранных зубах будет удален, а места подсушены ватными тампонами. GCF будет собираться с помощью периобумажных полосок (ProFlow, Amityville, NY, USA), аккуратно вставленных в десневую борозду на 20 с. Положение полоски отмечено на диаграмме, чтобы обеспечить идентичное место взятия образца при последующих наблюдениях. В случае загрязнения кровью полоску выбрасывают, а забор повторяют через 5 мин. Объем GCF записывают с использованием Peritron 8000 (Proflow) и выражают в мкл. Одна полоска вмещает примерно 0,1-0,4 мкл GCF. Затем полоски переносят в пластиковые пробирки и хранят при температуре -80ºC до дальнейшего анализа.

Для образцов слюны стимулированную парафином цельную слюну собирают в течение 3-минутного периода, по крайней мере, через два часа после любого приема пищи. Примерное количество слюны при нормальной скорости будет составлять 3-6 мл через 3 минуты. Собранную слюну немедленно замораживают аликвотами по 1,5 мл и хранят при температуре -80°С до дальнейшего анализа. Оставшаяся часть образца будет уничтожена после завершения исследования.

Лабораторные процедуры:

Анализ цитокинов на GCF: Поглощенный GCF элюируют в 120 мкл PBS (фосфатно-солевой буфер), содержащего 0,05 % Tween 20. Уровни INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 и IL-12 определяют с помощью панелей luminex и мультиплексного иммуноанализа (LINCOplex, LINCO Research, Inc, США) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрации цитокинов выражены в пг/мл.

Анализ микробиома слюны: общая бактериальная ДНК будет извлечена из 2 мл размороженного образца слюны для идентификации и сравнения состава и стабильности общих микробных сообществ в двух испытуемых группах посредством секвенирования ампликона филогенетического маркерного гена 16S рРНК. Гипервариабельная область V3-V4 генов 16S рРНК бактерий и архей будет амплифицирована с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров 341F и 806R и проанализирована с помощью установленного высокопроизводительного конвейера секвенирования, разработанного партнером по микробиологии Копенгагенского университета на основе современного технологии секвенирования (Illumina Mi-Seq) и специализированные биоинформационные инструменты, специально разработанные для анализа больших наборов данных микробиома.

Статистические методы:

Все данные будут обрабатываться с помощью программного обеспечения SPSS (v 22.0; Чикаго, штат Иллинойс, США). Последующие значения сравнивают с исходным уровнем в каждой группе с помощью парного двустороннего критерия Уилкоксона, а различия между группами анализируют с помощью непарного критерия Уилкоксона. Значение p <0,05 считается статистически значимым.

Управление данными:

Все собранные данные будут обрабатываться в соответствии с Законом об обработке персональных данных и «Законом о здравоохранении». При включении участникам будет присвоен уникальный номер и отдельный протокол без личного кода.

Научная значимость:

Исследование может предоставить доказательства того, что пробиотические таблетки могут влиять на клинические маркеры воспаления десен и/или про- и противовоспалительные цитокины, что может привести к новым стратегиям лечения гингивита и поддержания здоровья полости рта. Использование пробиотических бактерий при лечении стоматологических заболеваний может быть одним из вариантов применения антибиотиков. Кроме того, это даст новое представление о влиянии новых штаммов на микробиом слюны, что должно стать важным событием в бактериотерапии.

Риски и побочные эффекты:

Участники полностью застрахованы страховкой пациента Школы стоматологии, которая покрывает любой ущерб, нанесенный участнику испытания во время исследования. Никаких побочных эффектов при лечении пробиотиками не ожидается. Пробиотики обычно считаются безопасными (GRAS: общепризнанные безопасными) Европейским управлением по безопасности пищевых продуктов (EFSA).

Участников попросят сообщить о любом неожиданном неблагоприятном эффекте.

Этические соображения:

Участники не получат прямой пользы от лечения, но знания, полученные в ходе исследования, могут способствовать предотвращению микробных заболеваний полости рта, например. кариес и пародонтит, в дальнейшем. Сбор образцов не вызывает дискомфорта у участников, а таблетки не имеют известных побочных эффектов. Таким образом, личная выгода участников соответствует минимальному риску и дискомфорту участников. Участники, завершившие пробную версию, получат компенсацию в виде подарочного ваучера на 500 датских крон от Magasin. Следует подчеркнуть, что положительные, отрицательные и неубедительные результаты будут опубликованы.

График:

Подготовка исследования будет осуществляться зимой 2014/2015 гг. После этического одобрения пациенты могут быть привлечены к участию в исследовании зимой/весной 2015 года.