Effekter på tabletter som innehåller probiotiska kandidatstammar

Bakgrund:

Den mänskliga saliven erbjuder en lättillgänglig och icke-invasiv möjlighet att studera bakteriell interaktion såväl som biomarkörer för hälsa och sjukdom. Human Microbiome Project har gett insikter om att biofilmerna i och utanför våra kroppar har utvecklats tillsammans med mänskligheten och spelar en viktig roll för hälsan. Detta gäller även för munhålan där mikrobiotan inte spelar en passiv roll utan aktivt bidrar till att upprätthålla munhälsan. Men vissa ekologiska förändringar i mikrobiomet tillåter patogener att manifestera sig och orsaka orala sjukdomar. Enligt den ekologiska plackhypotesen är karies och parodontit resultatet av miljöinducerad överväxt av sura respektive proteolytiska arter.

Bakterioterapi är termen som används när en ofarlig effektorstam implanteras i värdens mikroflora för att bibehålla eller återställa en naturlig mikrobiom genom interferens och/eller hämning av andra mikroorganismer, och särskilt patogener. Detta kan öppna upp för alternativa sätt att bekämpa infektionssjukdomar med mindre skadliga biverkningar och kan också hjälpa till vid behandling av sjukdomar som inte verkar ha något med bakterier att göra, såsom astma, fetma och diabetes. Probiotiska bakterier, definierade som "Levande mikroorganismer som, när de administreras i adekvata mängder, ger värden en hälsofördel" (WHO), är ofta föreslagna kandidater för bakterioterapi. De potentiella verkningsmekanismerna är fortfarande inte helt klarlagda men det verkar tydligt att det finns lokala (direkta) såväl som systemiska (indirekta) effekter. Enligt Reid är de potentiella vägarna: i) samaggregation med patogener och tillväxthämning, ii) produktion av bakteriocin och väteperoxid, iii) konkurrerande uteslutning genom antagonistiska aktiviteter på adhesionsställen och näring, iv) systemisk immunmodulering.

In vitro-studier har visat effekt på samaggregation och tillväxthämning och kliniska studier har visat effekt på kliniska parametrar för gingival inflammation men fortfarande är lite känt om den immunmodulerande effekten och interaktionen mellan värd och mikrober.

Parodontala sjukdomar är bland de mest utbredda infektionssjukdomarna hos människan och kan leda till tandlossning. Om den lämnas obehandlad kan tandköttsinflammation leda till parodontit.

Munhålans olika ytor är alla kontinuerligt badade i saliv och flera patogena arter i saliv har associerats med parodontit sjukdom. Studier av probiotiska bakteriers mikrobiella effekt på munhälsan har hittills baserats på konventionella odlingsmetoder och har fokuserats på en eller ett fåtal stammar. De nya teknikerna med hög genomströmning ger möjlighet till en mer heltäckande och exakt bild av bakterieprofilerna, men hittills har endast ett fåtal studier använt sekvensering för att bestämma den bakteriella sammansättningen av saliv efter intag av probiotiska bakterier. De flesta analyserar sammansättningen efter ett mycket kortvarigt intag av de probiotiska bakterierna. Därför finns det bara en studie som har analyserat sammansättningen efter längre interventionsperiod och korrelerat detta med kliniska resultat.

Syfte:

Syftet med studien är att undersöka effekten av tabletter som innehåller probiotiska kandidatstammar, på gingival inflammation och nivåerna av utvalda pro- och antiinflammatoriska cytokiner i gingival crevicular fluid (GCF). Ett sekundärt syfte är att beskriva tabletternas effekt på salivmikrobiomet. Nollhypotesen är att de kliniska mätningarna, nivåerna av cytokiner och mikrobiell sammansättning av saliv inte kommer att skilja sig från baslinjen eller mellan studien och kontrollgruppen.

Studera design:

Studien är planerad som en dubbelblind; placebokontrollerad randomiserad studie med två parallella armar. Insatstiden är planerad att vara 4 veckor. Studieplanen kommer att lämnas in för etiskt godkännande.

Material:

Deltagarna kommer att rekryteras bland patienter på kliniken vid tandläkarhögskolan och genom www.forsogsperson.dk. 80 deltagare planeras att registreras efter informerat samtycke och sedan slumpmässigt fördelas till antingen den probiotiska gruppen eller placebogruppen. Provstorleken bestämdes genom en effektanalys (a=0,05 och β=0,2) baserat på tidigare erhållna värden på BOP. Det behövs 74 deltagare och 80 är anmälda för att kompensera för förväntat avhopp.

Rekrytering: Om deltagarna efter att ha läst meddelandet om studien uttrycker intresse för studien kommer de att bjudas in till ett informationsmöte med biträdande professorn och tandläkaren Mette Kirstine Keller. Inför tillsättningen informeras deltagarna om att de har rätt att ta med en ledsagare till informationsmötet. De kommer också att få den skriftliga informationen om studien. Förordnandet kommer att ske i ett mötesrum utan andra personer närvarande än utredaren, deltagaren och eventuellt en ledsagare. Den muntliga informationen kommer att baseras på den skriftliga informationen och ges på ett enkelt språk utan några värdeladdade termer. Utredaren ansvarar för att deltagaren har förstått all given information innan projektet påbörjas. Alla kommentarer från deltagaren tas i relevant hänsyn både under informationsintervjun och studien. Deltagaren kan när som helst dra sig ur projektet. Det informerade samtycket för deltagande i rättegången ges på grundval av muntlig och skriftlig information och ett sådant samtycke kan lämnas efter minst 24 timmars betänketid. Projektet omfattar inte försökspersoner som på grund av fysiska eller psykiska handikapp inte kan ge det informerade samtycket.

Metoder:

Intervention:

Efter informerat samtycke, baslinjeundersökning och provtagning, fördelas deltagarna slumpmässigt till en av studiegrupperna och får tillgång till antingen probiotiska tabletter eller placebotabletter.

De probiotiska tabletterna innehåller Lactobacillus rhamnosus PB01 och Lactobacillus curvatus P2-2 i en dos av 1 * 109 CFU/tablett. Stammarna är valda baserat på in vitro-analyser som undersöker tillväxthämning av patogener och immunmodulering. Placebotabletterna är identiska i storlek och sammansättning men utan tillsats av de probiotiska stammarna. Båda tabletterna tillhandahålls av Bifodan A/S. Deltagarna kommer att instrueras att ta en tablett på morgonen och en på kvällen trettio minuter efter tandborstning. Tabletterna är förpackade i identiska krukor med färgkodning. Koden kommer att bevaras från utredarna tills analysen är klar.

Deltagarna kommer att ta två tabletter om dagen i fyra veckor. Uppföljningsregistreringar görs efter två veckor, fyra veckor och sex veckor.

Kliniska procedurer:

Vid varje besök kommer saliv och GCF (Gingival Crevicular Fluid) att samlas in och sedan registreras plackindex (PI) och blödning vid sondering (BOP). För insamling av GCF kommer två kontralaterala buckala ställen från de övre framtänderna, hörntänderna eller premolarerna att väljas från varje deltagare. Visuell supragingival plack på de valda tänderna kommer att tas bort och platserna kommer att torkas med bomullspellets. GCF kommer att samlas in med periopaper-remsor (ProFlow, Amityville, NY, USA) som försiktigt sätts in i tandköttssulcusen i 20 s. Placeringen av remsan är markerad på ett diagram för att säkra det identiska provstället vid uppföljningarna. Vid blodförorening töms remsan och provtagningen upprepas efter 5 min. Volymen av GCF registreras med en Peritron 8000 (Proflow) och uttrycks i μL. En remsa rymmer ungefär 0,1-0,4 μL GCF. Remsorna överförs sedan till plaströr och förvaras vid -80ºC tills vidare analys.

För salivproverna samlas paraffinstimulerad hel saliv under en 3-minutersperiod minst två timmar efter eventuellt födointag. Den ungefärliga mängden saliv vid normal hastighet kommer att vara 3-6 ml efter 3 minuter. Den uppsamlade saliven fryses omedelbart i 1,5 ml alikvoter och förvaras vid -80ºC tills vidare analys. Resten av provet kommer att förstöras efter avslutad studie.

Laboratorieprocedurer:

Analys av cytokiner på GCF: Den absorberade GCF elueras i 120 μL PBS (fosfatbuffrad saltlösning) innehållande 0,05 % Tween 20. Nivåerna av INFy, TNF-α, IL-8, IL-10 och IL-12 bestäms med hjälp av luminex och multiplex immunoanalyspaneler (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) i enlighet med tillverkarens manual. Koncentrationerna av cytokinerna uttrycks som pg/ml.

Analys av salivmikrobiomet: Totalt bakteriellt DNA kommer att extraheras från 2 ml tinat salivprov för identifiering och jämförelse av sammansättningen och stabiliteten hos de totala mikrobiella samhällena i de två försöksgrupperna genom amplikonsekvensering av den fylogenetiska markörgenen 16S rRNA. Den hypervariabla regionen V3-V4 av bakteriella och arkeala 16S rRNA-gener kommer att PCR-amplifieras med hjälp av specifika primrar 341F och 806R och analyseras av en etablerad sekvenseringspipeline med hög genomströmning utvecklad av mikrobiologipartnern från Köpenhamns universitet baserat på toppmoderna sekvenseringsteknologier (Illumina Mi-Seq) och skräddarsydda bioinformatiska verktyg speciellt designade för analys av stora mikrobiomdatauppsättningar.

Statistiska metoder:

All data kommer att behandlas med SPSS-programvara (v 22.0; Chicago, Ill, USA). Uppföljningsvärdena jämförs med baslinjen inom varje grupp med Wilcoxon parade tvåsidiga test och skillnader mellan grupperna analyseras med Wilcoxon oparade test. Ett p-värde < 0,05 anses vara statistiskt signifikant.

Datahantering:

All insamlad data kommer att behandlas i enlighet med lagen om behandling av personuppgifter och "Hälsolagen". Vid inkluderingen kommer deltagarna att tilldelas ett unikt nummer och ett separat protokoll utan personnummer.

Vetenskaplig betydelse:

Studien kan ge bevis för att de probiotiska tabletterna kan påverka kliniska markörer för gingival inflammation och/eller pro- och antiinflammatoriska cytokiner, vilket kan leda till nya strategier för att hantera gingivit och bibehålla munhälsa. Användning av probiotiska bakterier vid behandling av tandsjukdomar kan vara ett alternativ för användning av antibiotika. Dessutom kommer det att ge nya insikter om effekten av att introducera nya stammar till salivmikrobiomet, vilket antas vara en betydande händelse inom bakterioterapi.

Risker och negativa effekter:

Deltagarna täcks helt av Tandläkarhögskolans patientförsäkring som täcker eventuella skador på försöksdeltagaren under studien. Det finns inga förväntade biverkningar av behandlingen med probiotika. Probiotika anses allmänt vara säkra (GRAS: Generally Recognized As Safe) av European Food Safety Authority (EFSA).

Deltagarna kommer att uppmanas att rapportera eventuella oväntade negativa effekter.

Etiska betänkligheter:

Deltagarna kommer inte att dra direkt nytta av behandlingen, men kunskapen från studien kan bidra till att förebygga mikrobiella sjukdomar i munnen, t.ex. karies och parodontit, i framtiden. Provtagningen orsakar inget obehag för deltagarna och tabletterna har inga kända biverkningar. Därför motsvarar deltagarnas personliga nytta den minimala risken och obehaget för deltagarna. Deltagarna som slutför provet kommer att kompenseras med ett presentkort på 500 DKK till Magasin. Det bör betonas att positiva, negativa och ofullständiga resultat kommer att publiceras.

Tidsschema:

Förberedelse av studien kommer att genomföras under vintern 2014/2015. Efter etiskt godkännande kan patienter rekryteras till studien under vintern/våren 2015.