Účinky na tablety obsahující probiotické kandidátské kmeny

Pozadí:

Lidské sliny nabízejí snadno dostupnou a neinvazivní příležitost ke studiu bakteriálních interakcí i biomarkerů zdraví a nemoci. Projekt Human Microbiome Project poskytl poznatky o tom, že biofilmy uvnitř i vně našeho těla se vyvinuly společně s lidstvem a hrají důležitou roli pro zdraví. To platí i pro dutinu ústní, ve které mikrobiota nehraje pasivní roli, ale aktivně přispívá k udržení zdraví ústní dutiny. Určité ekologické posuny v mikrobiomu však umožňují patogenům projevit se a způsobit onemocnění ústní dutiny. Podle ekologické plakové hypotézy jsou kazy a parodontitida důsledkem environmentálně vyvolaného přemnožení acidurických a proteolytických druhů.

Bakterioterapie je termín používaný, když je neškodný efektorový kmen implantován do hostitelovy mikroflóry k udržení nebo obnovení přirozeného mikrobiomu interferencí a/nebo inhibicí jiných mikroorganismů, a zejména patogenů. To by mohlo otevřít alternativní způsoby boje s infekčními nemocemi s méně škodlivými vedlejšími účinky a může také pomoci při léčbě poruch, které zdánlivě nemají nic společného s bakteriemi, jako je astma, obezita a cukrovka. Probiotické bakterie, definované jako „živé mikroorganismy, které, když jsou podávány v adekvátním množství, prospívají hostiteli pro zdraví“ (WHO), jsou běžně navrhovanými kandidáty pro bakterioterapii. Potenciální mechanismy účinku nejsou stále plně pochopeny, ale zdá se jasné, že existují místní (přímé) i systémové (nepřímé) účinky. Podle Reida jsou potenciálními cestami: i) koagregace s patogeny a inhibice růstu, ii) produkce bakteriocinu a peroxidu vodíku, iii) kompetitivní vyloučení prostřednictvím antagonistických aktivit na místech adheze a výživy, iv) systémová imunomodulace.

Studie in vitro prokázaly účinek na koagregaci a inhibici růstu a klinické studie prokázaly účinek na klinické parametry zánětu dásní, ale stále je málo známo o imunomodulačním účinku a interakci hostitel-mikrob.

Parodontální onemocnění patří mezi nejrozšířenější infekční onemocnění u člověka a může vést až ke ztrátě zubů. Pokud se zánět dásní neléčí, může vést k paradentóze.

Různé povrchy ústní dutiny jsou všechny nepřetržitě omývány slinami a několik patogenních druhů ve slinách bylo spojováno s periodontálním onemocněním. Studie o mikrobiálním účinku probiotických bakterií na zdraví ústní dutiny byly dosud založeny na konvenčních kultivačních metodách a byly zaměřeny na jeden nebo několik kmenů. Nové vysoce výkonné techniky poskytují možnost komplexnějšího a přesnějšího obrazu bakteriálních profilů, ale dosud jen několik studií použilo sekvenování ke stanovení bakteriálního složení slin po příjmu probiotických bakterií. Většina analyzuje složení po velmi krátkodobém příjmu probiotických bakterií. Existuje tedy pouze jedna studie, která analyzovala složení po delší době intervence a korelovala to s klinickými výsledky.

Cíl:

Cílem studie je prozkoumat vliv tablet obsahujících probiotické kandidátní kmeny na zánět dásní a hladiny vybraných pro- a protizánětlivých cytokinů v gingivální štěrbinové tekutině (GCF). Sekundárním cílem je popsat účinek tablet na slinný mikrobiom. Nulová hypotéza je, že klinická měření, hladiny cytokinů a mikrobiální složení slin se nebudou lišit od výchozí hodnoty nebo mezi studijní a kontrolní skupinou.

Studovat design:

Studie je plánována jako dvojitě slepá; placebem kontrolovaná randomizovaná studie se dvěma paralelními rameny. Intervenční období je plánováno na 4 týdny. Studijní plán bude předložen k etickému schválení.

Materiál:

Účastníci budou vybráni mezi pacienty na klinice ve School of Dentistry a prostřednictvím www.forsogsperson.dk. Plánuje se, že 80 účastníků bude zapsáno po informovaném souhlasu a poté náhodně rozděleno do skupiny probiotik nebo skupiny s placebem. Velikost vzorku byla stanovena analýzou síly (a= 0,05 a p=0,2) na základě hodnot BOP získaných dříve. Je potřeba 74 účastníků a 80 je zapsáno, aby se kompenzovaly očekávané výpadky.

Nábor: Pokud účastníci po přečtení oznámení o studii vyjádří zájem o studii, budou pozváni na informační schůzku s odbornou asistentkou a zubní lékařkou Mette Kirstine Kellerovou. Před schůzkou budou účastníci informováni, že mají právo vzít si na informační schůzku doprovod. Obdrží také písemné informace o studiu. Schůzka proběhne v zasedací místnosti bez přítomnosti dalších osob než vyšetřovatele, účastníka a případně doprovodu. Ústní informace budou vycházet z písemných informací a budou podány srozumitelným jazykem bez jakýchkoli hodnotově zatížených výrazů. Řešitel odpovídá za to, že účastník porozuměl všem uvedeným informacím před zahájením projektu. Všechny komentáře od účastníka jsou brány v úvahu jak během informačního rozhovoru, tak během studie. Účastník může z projektu kdykoli odstoupit. Informovaný souhlas s účastí na hodnocení se uděluje na základě ústní a písemné informace a tento souhlas může být udělen po uplynutí nejméně 24 hodin času na rozmyšlenou. Projekt nezahrnuje subjekty, které z důvodu fyzického nebo mentálního postižení nemohou dát informovaný souhlas.

Metody:

Zásah:

Po informovaném souhlasu, základním vyšetření a odběru vzorků jsou účastníci náhodně rozděleni do jedné ze studijních skupin a dostanou buď probiotické tablety nebo placebo tablety.

Probiotické tablety obsahují Lactobacillus rhamnosus PB01 a Lactobacillus curvatus P2-2 v dávce 1 * 109 CFU/tableta. Kmeny jsou vybírány na základě in vitro testů zkoumajících inhibici růstu patogenů a imunomodulaci. Placebo tablety jsou identické co do velikosti a složení, ale bez přidání probiotických kmenů. Oba tablety poskytuje Bifodan A/S. Účastníci budou instruováni, aby si vzali jednu tabletu ráno a jednu večer třicet minut po vyčištění zubů. Tablety jsou baleny v identických kelímcích s barevným kódováním. Kód bude vyšetřovatelům uchován, dokud nebude analýza dokončena.

Účastníci budou užívat dvě tablety denně po dobu čtyř týdnů. Následné registrace se provádějí po dvou týdnech, čtyřech týdnech a šesti týdnech.

Klinické postupy:

Při každé návštěvě budou odebrány sliny a GCF (Gingival Crevicular Fluid) a poté bude registrován index plaku (PI) a krvácení při sondování (BOP). Pro odběr GCF budou od každého účastníka vybrána dvě kontralaterální bukální místa z horních řezáků, špičáků nebo premolárů. Vizuální supragingivální plak na vybraných zubech bude odstraněn a místa budou vysušena bavlněnými peletami. GCF bude odebírán pomocí periopaperových proužků (ProFlow, Amityville, NY, USA) jemně vložených do gingiválního sulku po dobu 20 sekund. Poloha proužku je vyznačena na grafu, aby bylo zajištěno identické místo vzorku při sledování. V případě kontaminace krve se proužek vybije a po 5 minutách se odběr opakuje. Objem GCF je zaznamenáván pomocí Peritron 8000 (Proflow) a vyjádřen v μl. Jeden pásek pojme přibližně 0,1-0,4 μl GCF. Proužky jsou poté přeneseny do plastových zkumavek a skladovány při -80 °C až do další analýzy.

Pro vzorky slin jsou parafinem stimulované celé sliny odebírány během 3 minut alespoň dvě hodiny po jakémkoli příjmu potravy. Přibližné množství slin při normální rychlosti bude 3-6 ml po 3 minutách. Odebrané sliny jsou okamžitě zmrazeny v 1,5 ml alikvotech a skladovány při -80 °C až do další analýzy. Zbytek vzorku bude po dokončení studie zničen.

Laboratorní postupy:

Analýza cytokinů na GCF: Absorbovaný GCF se eluuje ve 120 ul PBS (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) obsahujícím 0,05 % Tween 20. Hladiny INFy, TNF-a, IL-8, IL-10 a IL-12 jsou stanoveny pomocí luminexových a multiplexních imunoanalytických panelů (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) v souladu s manuálem výrobce. Koncentrace cytokinů jsou vyjádřeny jako pg/ml.

Analýza slinného mikrobiomu: Celková bakteriální DNA bude extrahována ze 2 ml rozmraženého vzorku slin pro identifikaci a srovnání složení a stability celkových mikrobiálních komunit ve dvou testovacích skupinách pomocí amplikonového sekvenování genu fylogenetického markeru 16S rRNA. Hypervariabilní oblast V3-V4 bakteriálních a archaálních 16S rRNA genů bude amplifikována pomocí PCR pomocí specifických primerů 341F a 806R a analyzována zavedeným vysoce výkonným sekvenačním potrubím vyvinutým partnerem z University of Copenhagen Microbiology na základě nejmodernějších technologií. sekvenační technologie (Illumina Mi-Seq) a na zakázku vyrobené bioinformatické nástroje speciálně navržené pro analýzu velkých souborů dat mikrobiomů.

Statistické metody:

Všechna data budou zpracována pomocí softwaru SPSS (v 22.0; Chicago, Illinois, USA). Hodnoty následného sledování se porovnávají s výchozí hodnotou v každé skupině Wilcoxonovým párovým oboustranným testem a rozdíly mezi skupinami jsou analyzovány Wilcoxonovým nepárovým testem. P-hodnota < 0,05 je považována za statisticky významnou.

Správa dat:

Se všemi shromážděnými údaji bude nakládáno v souladu se zákonem o zpracování osobních údajů a „Zdravotním zákonem“. Při zařazení bude účastníkům přiděleno jedinečné číslo a samostatný protokol bez rodného čísla.

Vědecký význam:

Studie může poskytnout důkaz, že probiotické tablety mohou ovlivnit klinické markery zánětu dásní a/nebo prozánětlivé a protizánětlivé cytokiny, což může vést k novým strategiím v léčbě gingivitidy a udržení zdraví ústní dutiny. Využití probiotických bakterií v léčbě zubních onemocnění by mohlo být jednou z možností použití antibiotik. Dále poskytne nové poznatky o efektu zavádění nových kmenů do slinného mikrobiomu, což má být významnou událostí v bakterioterapii.

Rizika a nežádoucí účinky:

Účastníci jsou plně hrazeni pacientským pojištěním The School of Dentistry, které kryje případné poškození účastníka studie během studie. U léčby probiotiky se neočekávají žádné vedlejší účinky. Probiotika jsou obecně považována za bezpečná (GRAS: Generally Recognized As Safe) Evropským úřadem pro bezpečnost potravin (EFSA).

Účastníci budou požádáni, aby nahlásili jakýkoli neočekávaný nepříznivý účinek.

Etická hlediska:

Účastníci nebudou mít přímý prospěch z léčby, ale poznatky získané studiem mohou přispět k prevenci mikrobiálních onemocnění v ústech, např. kazu a parodontitidy v budoucnu. Odběr vzorků nezpůsobuje účastníkům žádné nepohodlí a tablety nemají žádné známé vedlejší účinky. Osobní prospěch účastníků tedy odpovídá minimálnímu riziku a nepohodlí účastníků. Účastníci, kteří dokončí zkoušku, budou kompenzováni dárkovým poukazem v hodnotě 500 DKK do Magasinu. Je třeba zdůraznit, že budou publikovány pozitivní, negativní a neprůkazné výsledky.

Časový harmonogram:

Příprava studie bude probíhat v zimě 2014/2015. Po etickém schválení mohou být pacienti zařazeni do studie během zimy/jara 2015.