Efeitos em comprimidos contendo cepas candidatas a probióticos

Fundo:

A saliva humana oferece uma oportunidade de fácil acesso e não invasiva para estudar interações bacterianas, bem como biomarcadores de saúde e doença. O Projeto Microbioma Humano forneceu informações de que os biofilmes dentro e fora de nossos corpos co-evoluíram com a humanidade e desempenham um papel importante para a saúde. Isso também é verdade para a cavidade oral, na qual a microbiota não desempenha um papel passivo, mas contribui ativamente para a manutenção da saúde bucal. No entanto, certas mudanças ecológicas no microbioma permitem que patógenos se manifestem e causem doenças bucais. De acordo com a hipótese da placa ecológica, a cárie e a periodontite são o resultado do supercrescimento ambientalmente induzido de espécies acidúricas e proteolíticas, respectivamente.

Bacterioterapia é o termo usado quando uma cepa efetora inofensiva é implantada na microflora do hospedeiro para manter ou restaurar um microbioma natural por interferência e/ou inibição de outros microrganismos, especialmente patógenos. Isso pode abrir caminhos alternativos para combater doenças infecciosas com efeitos colaterais menos prejudiciais e também ajudar no tratamento de doenças que parecem não ter nada a ver com bactérias, como asma, obesidade e diabetes. Bactérias probióticas, definidas como "microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefício à saúde do hospedeiro" (OMS), são candidatos comumente sugeridos para bacterioterapia. Os potenciais mecanismos de ação ainda não são totalmente compreendidos, mas parece claro que existem efeitos locais (diretos) e sistêmicos (indiretos). De acordo com Reid, os caminhos potenciais são: i) coagregação com patógenos e inibição do crescimento, ii) produção de bacteriocina e peróxido de hidrogênio, iii) exclusão competitiva por meio de atividades antagônicas em locais de adesão e nutrição, iv) imunomodulação sistêmica.

Estudos in vitro mostraram efeito na coagregação e inibição do crescimento e estudos clínicos mostraram efeito em parâmetros clínicos de inflamação gengival, mas ainda pouco se sabe sobre o efeito imunomodulador e a interação hospedeiro-micróbio.

As doenças periodontais estão entre as doenças infecciosas mais difundidas no homem e podem levar à perda dos dentes. Se não for tratada, a gengivite pode levar à periodontite.

As diferentes superfícies da cavidade oral são continuamente banhadas em saliva e várias espécies patogênicas na saliva têm sido associadas à doença periodontal. Até agora, os estudos sobre o efeito microbiano das bactérias probióticas na saúde bucal foram baseados em métodos de cultivo convencionais e focados em uma ou algumas cepas. As novas técnicas de alto rendimento oferecem a possibilidade de uma imagem mais abrangente e precisa dos perfis bacterianos, mas até o momento apenas alguns estudos usaram o sequenciamento para determinar a composição bacteriana da saliva após a ingestão de bactérias probióticas. A maioria analisa a composição após uma ingestão muito curta das bactérias probióticas. Portanto, existe apenas um estudo que analisou a composição após um período de intervenção mais longo e a correlacionou com os desfechos clínicos.

Mirar:

O objetivo do estudo é investigar o efeito de comprimidos contendo cepas candidatas a probióticos, na inflamação gengival e nos níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias selecionadas no fluido crevicular gengival (GCF). Um objetivo secundário é descrever o efeito dos comprimidos no microbioma salivar. A hipótese nula é que as medidas clínicas, os níveis de citocinas e a composição microbiana da saliva não diferirão da linha de base ou entre o grupo de estudo e controle.

Design de estudo:

O estudo é planejado como duplo-cego; ensaio randomizado controlado por placebo com dois braços paralelos. O período de intervenção está previsto para ser de 4 semanas. O plano de estudo será submetido à aprovação ética.

Material:

Os participantes serão recrutados entre os pacientes da clínica da Faculdade de Odontologia e através de www.forsogsperson.dk. 80 participantes estão planejados para serem inscritos após o consentimento informado e, em seguida, alocados aleatoriamente para o grupo probiótico ou para o grupo placebo. O tamanho da amostra foi determinado por uma análise de poder (α= 0,05 e β=0,2) com base nos valores de BOP obtidos anteriormente. Setenta e quatro participantes são necessários e 80 estão inscritos para compensar as desistências esperadas.

Recrutamento: Se os participantes, após lerem o aviso sobre o estudo, manifestarem interesse no estudo, serão convidados para um encontro informativo com a professora assistente e dentista Mette Kirstine Keller. Antes da marcação, os participantes serão informados de que têm o direito de trazer um acompanhante para a reunião de informação. Eles também receberão as informações por escrito sobre o estudo. A consulta será realizada em uma sala de reuniões sem a presença de outras pessoas além do investigador, do participante e possivelmente de um acompanhante. As informações orais serão baseadas nas informações escritas e serão dadas em linguagem simples, sem quaisquer termos carregados de valor. O investigador é responsável por garantir que o participante tenha entendido todas as informações fornecidas antes do início do projeto. Todos os comentários do participante são levados em consideração tanto durante a entrevista de informação quanto durante o estudo. A qualquer momento o participante pode desistir do projeto. O consentimento informado para a participação no ensaio é dado com base em informação oral e escrita, podendo ser dado após pelo menos 24 horas de tempo de reflexão. O projeto não inclui sujeitos que, por deficiência física ou mental, não possam dar o consentimento informado.

Métodos:

Intervenção:

Após consentimento informado, exame inicial e amostragem, os participantes são designados aleatoriamente para um dos grupos de estudo e recebem comprimidos de probióticos ou comprimidos de placebo.

Os comprimidos probióticos contêm Lactobacillus rhamnosus PB01 e Lactobacillus curvatus P2-2 na dose de 1 * 109 CFU/comprimido. As cepas são escolhidas com base em ensaios in vitro que investigam a inibição do crescimento de patógenos e imunomodulação. Os comprimidos de placebo são idênticos em tamanho e composição, mas sem a adição das cepas probióticas. Ambos os comprimidos são fornecidos pela Bifodan A/S. Os participantes serão instruídos a tomar um comprimido pela manhã e outro à noite, trinta minutos após a escovação dos dentes. Os comprimidos são embalados em potes idênticos com código de cores. O código será mantido em sigilo pelos investigadores até que a análise seja concluída.

Os participantes tomarão dois comprimidos por dia durante quatro semanas. Registros de acompanhamento são realizados após duas semanas, quatro semanas e seis semanas.

Procedimentos clínicos:

A cada visita, saliva e GCF (Líquido Crevicular Gengival) serão coletados e, a seguir, serão registrados o índice de placa (PI) e o sangramento à sondagem (BOP). Para a coleta do GCF, dois sítios vestibulares contralaterais dos incisivos superiores, caninos ou pré-molares serão selecionados de cada participante. A placa supragengival visual nos dentes selecionados será removida e os locais serão secos com bolinhas de algodão. O GCF será coletado usando tiras de periopaper (ProFlow, Amityville, NY, EUA) inseridas suavemente no sulco gengival por 20 s. A posição da tira é marcada em um gráfico para garantir o local de amostra idêntico nos acompanhamentos. Em caso de contaminação sanguínea, a tira é descartada e a amostragem é repetida após 5 min. O volume de GCF é registrado usando um Peritron 8000 (Proflow) e expresso em μL. Uma tira contém aproximadamente 0,1-0,4 μL GCF. As tiras são então transferidas para tubos plásticos e armazenadas a -80ºC até posterior análise.

Para as amostras de saliva, a saliva total estimulada com parafina é coletada durante um período de 3 minutos, pelo menos duas horas após a ingestão de qualquer alimento. A quantidade aproximada de saliva na taxa normal será de 3-6 ml após 3 minutos. A saliva coletada é imediatamente congelada em alíquotas de 1,5 ml e armazenada a -80ºC até análise posterior. O restante da amostra será destruído após a conclusão do estudo.

Procedimentos laboratoriais:

Análise de citocinas no GCF: O GCF absorvido é eluído em 120 μL de PBS (solução salina tamponada com fosfato) contendo 0,05% de Tween 20. Os níveis de INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 e IL-12 são determinados usando painéis de imunoensaio luminex e multiplex (LINCOplex, LINCO Research, Inc, EUA) de acordo com o manual do fabricante. As concentrações das citocinas são expressas em pg/ml.

Análise do microbioma salivar: DNA bacteriano total será extraído de 2 ml de amostra de saliva descongelada para identificação e comparação da composição e estabilidade das comunidades microbianas totais nos dois grupos experimentais através do sequenciamento amplicon do gene marcador filogenético 16S rRNA. A região hipervariável V3-V4 dos genes 16S rRNA bacterianos e archaeais será amplificada por PCR usando primers específicos 341F e 806R e analisada por um pipeline de sequenciamento de alto rendimento desenvolvido pelo parceiro de microbiologia da Universidade de Copenhague com base no estado da arte tecnologias de sequenciamento (Illumina Mi-Seq) e ferramentas bioinformáticas personalizadas projetadas especificamente para análise de grandes conjuntos de dados de microbiomas.

Métodos estatísticos:

Todos os dados serão processados ​​com o software SPSS (v 22.0; Chicago, Illinois, EUA). Os valores de acompanhamento são comparados com a linha de base dentro de cada grupo pelo teste bilateral pareado de Wilcoxon e as diferenças entre os grupos são analisadas pelo teste não pareado de Wilcoxon. Um valor de p < 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

Gestão de dados:

Todos os dados recolhidos serão tratados em conformidade com a Lei do Tratamento de Dados Pessoais e "Lei da Saúde". Na inclusão, os participantes receberão um número único e um protocolo separado sem número de identificação pessoal.

Importância científica:

O estudo pode fornecer evidências de que os comprimidos probióticos podem influenciar marcadores clínicos de inflamação gengival e/ou citocinas pró e anti-inflamatórias, o que pode levar a novas estratégias no manejo da gengivite e na manutenção da saúde bucal. O uso de bactérias probióticas no tratamento de doenças bucais pode ser uma opção ao uso de antibióticos. Além disso, fornecerá novos insights sobre o efeito da introdução de novas cepas no microbioma salivar, que é considerado um evento significativo na bacterioterapia.

Riscos e Efeitos Adversos:

Os participantes estão totalmente cobertos pelo seguro do paciente da The School of Dentistry, que cobre qualquer dano ao participante do estudo durante o estudo. Não há efeitos colaterais esperados no tratamento com probióticos. Os probióticos são geralmente considerados seguros (GRAS: Geralmente Reconhecidos como Seguros) pela Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA).

Os participantes serão solicitados a relatar qualquer efeito adverso inesperado.

Considerações éticas:

Os participantes não se beneficiarão diretamente do tratamento, mas o conhecimento adquirido com o estudo pode contribuir para a prevenção de doenças de origem microbiana na boca, por exemplo, cárie e periodontite, no futuro. A coleta de amostras não causa desconforto aos participantes e os comprimidos não apresentam efeitos colaterais conhecidos. Portanto, o benefício pessoal dos participantes corresponde ao mínimo risco e desconforto para os participantes. Os participantes que concluírem o teste serão recompensados ​​com um vale-presente de 500 DKK para o Magasin. Ressalta-se que resultados positivos, negativos e inconclusivos serão publicados.

Horário:

A preparação do estudo será realizada no inverno 2014/2015. Após aprovação ética, os pacientes podem ser recrutados para o estudo durante o inverno/primavera de 2015.