Hatás a probiotikum-jelölt törzseket tartalmazó tablettákra

Háttér:

Az emberi nyál könnyen hozzáférhető és nem invazív lehetőséget kínál a bakteriális kölcsönhatások, valamint az egészség és a betegségek biomarkereinek tanulmányozására. A Human Microbiome Project betekintést nyújtott arra, hogy a testünkön belüli és kívüli biofilmek az emberiséggel együtt fejlődtek, és fontos szerepet játszanak az egészségben. Ez igaz a szájüregre is, amelyben a mikrobiota nem játszik passzív szerepet, hanem aktívan hozzájárul a száj egészségének megőrzéséhez. A mikrobiomában bekövetkezett bizonyos ökológiai eltolódások azonban lehetővé teszik a kórokozók megjelenését és szájbetegségek kialakulását. Az ökológiai plakk-hipotézis szerint a fogszuvasodás és a parodontitis a savas, illetve a proteolitikus fajok környezeti indukált túlszaporodásának eredménye.

Bakterioterápia az a kifejezés, amikor egy ártalmatlan effektor törzset ültetnek be a gazdaszervezet mikroflórájába, hogy fenntartsák vagy helyreállítsák a természetes mikrobiomot más mikroorganizmusok, és különösen kórokozók interferenciájával és/vagy gátlásával. Ez alternatív módszereket nyithat meg a kevésbé káros mellékhatásokkal járó fertőző betegségek elleni küzdelemben, és segíthet olyan betegségek kezelésében is, amelyeknek úgy tűnik, semmi közük a baktériumokhoz, mint például az asztma, az elhízás és a cukorbetegség. A probiotikus baktériumok, amelyeket úgy definiálnak, mint "élő mikroorganizmusok, amelyek megfelelő mennyiségben adják be a gazdaszervezet egészségét" (WHO), gyakran javasolt jelöltek bakterioterápiára. A lehetséges hatásmechanizmusok még mindig nem teljesen ismertek, de egyértelműnek tűnik, hogy vannak helyi (közvetlen), valamint szisztémás (közvetett) hatások. Reid szerint a lehetséges utak a következők: i) a kórokozókkal való együttes aggregáció és a növekedés gátlása, ii) bakteriocin és hidrogén-peroxid termelés, iii) kompetitív kirekesztés a tapadási helyeken és a táplálkozásban kifejtett antagonista hatások révén, iv) szisztémás immunmoduláció.

In vitro vizsgálatok kimutatták a ko-aggregációra és a növekedés gátlására gyakorolt ​​hatást, a klinikai vizsgálatok pedig a gingivagyulladás klinikai paramétereire gyakorolt ​​hatást, de még mindig keveset tudunk az immunmoduláló hatásról és a gazda-mikroba kölcsönhatásról.

A fogágybetegségek az egyik legelterjedtebb fertőző betegség az emberben, és fogvesztéshez vezethetnek. Ha nem kezelik, a fogínygyulladás fogágygyulladáshoz vezethet.

A szájüreg különböző felületei folyamatosan nyálban vannak, és a nyálban számos patogén fajt összefüggésbe hoznak a parodontális betegséggel. A probiotikus baktériumok szájhigiéniára gyakorolt ​​mikrobiális hatásával kapcsolatos vizsgálatok eddig hagyományos tenyésztési módszereken alapultak, és egy vagy néhány törzsre összpontosítottak. Az új nagy áteresztőképességű technikák átfogóbb és pontosabb képet adnak a baktériumprofilokról, de ez idáig csak néhány tanulmány alkalmazta a szekvenálást a nyál bakteriális összetételének meghatározására probiotikus baktériumok bevétele után. A legtöbben a probiotikus baktériumok nagyon rövid távú bevitele után elemzik az összetételt. Ennélfogva csak egy tanulmány elemezte az összetételt hosszabb beavatkozási időszak után, és ezt korrelálta a klinikai eredményekkel.

Cél:

A vizsgálat célja a probiotikus jelölt törzseket tartalmazó tabletták ínygyulladásra, valamint a kiválasztott pro- és gyulladásgátló citokinek szintjének vizsgálata a gingival crevicularis folyadékban (GCF). Másodlagos cél a tabletták nyál mikrobiomára gyakorolt ​​hatásának leírása. A nullhipotézis az, hogy a klinikai mérések, a citokinek szintje és a nyál mikrobiális összetétele nem tér el a kiindulási értéktől, illetve a vizsgálati és a kontrollcsoport között.

Dizájnt tanulni:

A tanulmányt kettős vakként tervezik; placebo-kontrollos randomizált vizsgálat két párhuzamos karral. A beavatkozás időtartama a tervek szerint 4 hét. A vizsgálati tervet etikai jóváhagyásra benyújtják.

Anyag:

A résztvevőket a Fogorvostudományi Iskola klinikájának páciensei közül, valamint a www.forsogsperson.dk webhelyen toborozzák. A tervek szerint 80 résztvevőt vesznek fel tájékozott beleegyezés után, majd véletlenszerűen beosztják a probiotikus csoportba vagy a placebo csoportba. A minta méretét teljesítményanalízissel határoztuk meg (α=0,05 és β=0,2) a korábban kapott BOP értékek alapján. Hetvennégy résztvevőre van szükség, és 80-an jelentkeznek be, hogy kompenzálják a várható lemorzsolódást.

Toborzás: Ha a résztvevők a vizsgálatról szóló értesítés elolvasása után érdeklődést mutatnak a vizsgálat iránt, információs találkozóra hívják őket Mette Kirstine Keller adjunktushoz és fogorvoshoz. Az időpont egyeztetés előtt a résztvevők tájékoztatást kapnak arról, hogy jogukban áll kísérőt vinni a tájékoztatóra. A tanulmányról írásos tájékoztatást is kapnak. A találkozóra egy tárgyalóteremben kerül sor, a nyomozón, a résztvevőn és esetleg egy kísérőn kívül más személyek jelenléte nélkül. A szóbeli tájékoztatás az írásbeli tájékoztatáson alapul, és közérthető nyelven, értékkel bíró kifejezések nélkül történik. A vizsgáló felelős azért, hogy a résztvevő megértse az összes megadott információt a projekt megkezdése előtt. A résztvevő minden megjegyzését relevánsan figyelembe veszik mind az információs interjú, mind a vizsgálat során. A résztvevő bármikor kiléphet a projektből. A tárgyaláson való részvételhez való tájékozott hozzájárulás szóbeli és írásbeli tájékoztatás alapján történik, amely legalább 24 órás gondolkodási idő után adható. A projekt nem tartalmaz olyan alanyokat, akik testi vagy szellemi fogyatékosságuk miatt nem adhatják meg a tájékozott beleegyezésüket.

Mód:

Közbelépés:

Tájékozott beleegyezés, kiindulási vizsgálat és mintavétel után a résztvevőket véletlenszerűen besorolják az egyik vizsgálati csoportba, és probiotikus tablettát vagy placebo tablettát kapnak.

A probiotikus tabletták Lactobacillus rhamnosus PB01-et és Lactobacillus curvatus P2-2-t tartalmaznak 1*109 CFU/tabletta dózisban. A törzseket a kórokozók növekedésének gátlását és az immunmodulációt vizsgáló in vitro vizsgálatok alapján választottuk ki. A placebo tabletták méretükben és összetételükben azonosak, de probiotikus törzsek hozzáadása nélkül. Mindkét tablettát a Bifodan A/S biztosítja. A résztvevők azt az utasítást kapják, hogy a fogmosás után harminc perccel vegyenek be egy tablettát reggel és egyet este. A tabletták azonos, színkóddal ellátott edényekbe vannak csomagolva. A kódot az elemzés befejezéséig megőrzik a nyomozóktól.

A résztvevők napi két tablettát vesznek be négy héten keresztül. Az utóregisztráció két hét, négy hét és hat hét elteltével történik.

Klinikai eljárások:

Minden vizit alkalmával nyálat és GCF-et (Gingival Crevicular Fluid) gyűjtenek, majd regisztrálják a plakk indexet (PI) és a vérzést a szondázáskor (BOP). A GCF gyűjtéséhez minden résztvevőtől két ellenoldali bukkális helyet választanak ki a felső metszőfogakból, szemfogakból vagy premolárisokból. A kiválasztott fogakról a vizuális supragingivális lepedéket eltávolítjuk, a helyeket vattapellettel szárítjuk. A GCF-et periopapír csíkok (ProFlow, Amityville, NY, USA) segítségével gyűjtik össze, amelyeket óvatosan helyeznek be a gingivális barázdába 20 másodpercig. A csík helyzetét egy diagramon jelöljük, hogy az azonos mintahelyet biztosítsa a nyomon követésnél. Vérszennyezés esetén a csíkot le kell üríteni, és a mintavételt 5 perc múlva megismételni. A GCF térfogatát Peritron 8000 (Proflow) segítségével rögzítjük, és μl-ben fejezzük ki. Egy csík körülbelül 0,1-0,4-et tart μL GCF. A csíkokat ezután műanyag csövekbe helyezik, és -80 °C-on tárolják a további elemzésig.

A nyálmintákhoz paraffin-stimulált teljes nyálat kell gyűjteni 3 percen keresztül, legalább két órával az étkezés után. A nyál hozzávetőleges mennyisége normál sebesség mellett 3 perc múlva 3-6 ml. Az összegyűjtött nyálat azonnal lefagyasztjuk 1,5 ml-es alikvot részekben, és további elemzésig -80 °C-on tároljuk. A minta fennmaradó részét a vizsgálat befejezése után megsemmisítik.

Laboratóriumi eljárások:

Citokinek analízise GCF-en: Az abszorbeált GCF-et 0,05% Tween 20-at tartalmazó 120 μl PBS-ben (foszfáttal pufferolt sóoldat) eluáljuk. Az INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 és IL-12 szintjeit luminex és multiplex immunoassay panelek (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) segítségével határozzák meg a gyártó kézikönyvének megfelelően. A citokinek koncentrációját pg/ml-ben fejezzük ki.

A nyál mikrobióma elemzése: A teljes bakteriális DNS-t 2 ml felolvasztott nyálmintából vonják ki, hogy azonosítsák és összehasonlítsák az összes mikrobiális közösség összetételét és stabilitását a két vizsgálati csoportban a 16S rRNS filogenetikai markergén amplikon szekvenálásával. A bakteriális és archaeális 16S rRNS gének hipervariábilis V3-V4 régióját PCR amplifikálják specifikus 341F és 806R primerek segítségével, és a Koppenhágai Egyetem mikrobiológiai partnere által kifejlesztett nagy áteresztőképességű szekvenáló csővezeték segítségével elemzik a legmodernebb technika alapján. szekvenálási technológiák (Illumina Mi-Seq) és egyedi készítésű bioinformatikai eszközök, amelyeket kifejezetten nagy mikrobióm-adatkészletek elemzésére terveztek.

Statisztikai módszerek:

Minden adatot SPSS szoftverrel dolgozunk fel (v 22.0; Chicago, Ill, USA). A követési értékeket minden csoporton belül Wilcoxon páros kétoldali teszttel hasonlítják össze a kiindulási értékkel, és a csoportok közötti különbségeket Wilcoxon páratlan teszttel elemezték. A 0,05-nél kisebb p-érték statisztikailag szignifikáns.

Adatkezelés:

Minden összegyűjtött adatot a személyes adatok kezeléséről szóló törvény és az „egészségügyi törvény” előírásai szerint kezelünk. A részvételkor a résztvevők egyedi számot és külön jegyzőkönyvet kapnak személyi azonosító szám nélkül.

Tudományos jelentősége:

A tanulmány bizonyítékot szolgáltathat arra, hogy a probiotikus tabletták befolyásolhatják az ínygyulladás klinikai markereit és/vagy a pro- és gyulladásgátló citokineket, ami új stratégiákhoz vezethet a fogínygyulladás kezelésében és a száj egészségének megőrzésében. A probiotikus baktériumok alkalmazása fogászati ​​betegségek kezelésében lehet az egyik lehetőség, az antibiotikumok alkalmazása. Ezen túlmenően új betekintést ad a nyál mikrobiómába történő új törzsek bejuttatásának hatásába, amely a bakterioterápia jelentős eseménye.

Kockázatok és káros hatások:

A résztvevőket teljes mértékben fedezi a The School of Dentistry betegbiztosítása, amely fedezi a vizsgálat során a vizsgálatban résztvevőt ért károkat. A probiotikumos kezelésnek nem várható mellékhatása. A probiotikumokat az Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság (EFSA) általában biztonságosnak tekinti (GRAS: Általánosan biztonságosnak elismert).

A résztvevőket felkérjük, hogy jelentsenek minden váratlan káros hatást.

Etikai megfontolások:

A résztvevők közvetlenül nem profitálnak a kezelésből, de a vizsgálat során megszerzett ismeretek hozzájárulhatnak a mikrobiális eredetű szájbetegségek megelőzéséhez, pl. fogszuvasodás és parodontitis, a jövőben. A mintagyűjtés nem okoz kellemetlenséget a résztvevőknek, és a tablettáknak nincs ismert mellékhatása. Ezért a résztvevők személyes haszna megfelel a résztvevőket érő minimális kockázatnak és kényelmetlenségnek. A próbát teljesítő résztvevők 500 DKK értékű ajándékutalványt kapnak a Magasinba. Hangsúlyozni kell, hogy a pozitív, negatív és nem meggyőző eredményeket közzéteszik.

Ütemterv:

A tanulmány elkészítése 2014/2015 telén történik. Az etikai jóváhagyást követően a betegek 2015 telén/tavaszán vehetők részt a vizsgálatban.