프로바이오틱 후보 균주를 포함하는 정제에 대한 효과

배경:

인간 타액은 건강과 질병의 바이오마커뿐만 아니라 박테리아 상호 작용을 연구할 수 있는 쉽게 접근할 수 있고 비침습적인 기회를 제공합니다. 인간 마이크로바이옴 프로젝트는 우리 몸 안팎의 바이오필름이 인류와 함께 진화하며 건강에 중요한 역할을 한다는 통찰력을 제공했습니다. 이것은 미생물군이 수동적인 역할을 하는 것이 아니라 구강 건강 유지에 능동적으로 기여하는 구강의 경우에도 마찬가지입니다. 그러나 마이크로바이옴의 특정 생태적 변화로 인해 병원균이 나타나 구강 질환을 일으킬 수 있습니다. 생태 플라크 가설에 따르면 우식증과 치주염은 각각 산성뇨와 단백질 분해 종의 환경 유발 과증식의 결과입니다.

세균 요법은 다른 미생물, 특히 병원균의 간섭 및/또는 억제를 통해 천연 미생물 군집을 유지하거나 복원하기 위해 무해한 이펙터 균주를 숙주의 미생물총에 이식할 때 사용되는 용어입니다. 이것은 덜 유해한 부작용으로 전염병과 싸우는 대체 방법을 열 수 있으며 천식, 비만 및 당뇨병과 같은 박테리아와 관련이없는 것으로 보이는 질병의 치료에도 도움이 될 수 있습니다. "적절한 양을 투여했을 때 숙주에게 건강상의 이점을 부여하는 살아있는 미생물"(WHO)로 정의되는 프로바이오틱 박테리아는 일반적으로 박테리아 요법의 후보로 제안됩니다. 잠재적인 작용 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았지만 전신(간접) 효과뿐만 아니라 국소(직접) 효과가 있음이 분명해 보입니다. Reid에 따르면 잠재적인 방법은 i) 병원체와의 공동 응집 및 성장 억제, ii) 박테리오신 및 과산화수소 생산, iii) 접착 부위 및 영양에 대한 길항 활동을 통한 경쟁적 배제, iv) 전신 면역 조절입니다.

시험관 내 연구는 공동 응집 및 성장 억제에 대한 효과를 보여주었고 임상 연구는 잇몸 염증의 임상적 매개변수에 대한 효과를 보여주었지만 여전히 면역조절 효과 및 숙주-미생물 상호작용에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

치주 질환은 인간에게 가장 널리 퍼진 전염병 중 하나이며 치아 손실로 이어질 수 있습니다. 치은염을 치료하지 않고 방치하면 치주염으로 이어질 수 있습니다.

구강의 다양한 표면은 모두 타액으로 지속적으로 적셔지며 타액의 여러 병원성 종은 치주 질환과 관련이 있습니다. 프로바이오틱스 박테리아가 구강 건강에 미치는 미생물 효과에 대한 연구는 지금까지 기존의 재배 방법을 기반으로 했으며 하나 또는 몇 가지 균주에 초점을 맞추었습니다. 새로운 고처리량 기술은 박테리아 프로파일의 보다 포괄적이고 정확한 그림에 대한 가능성을 제공하지만 현재까지 프로바이오틱 박테리아 섭취 후 타액의 박테리아 구성을 결정하기 위해 시퀀싱을 사용한 연구는 소수에 불과합니다. 대부분은 프로바이오틱스 박테리아를 매우 단기간 섭취한 후 구성을 분석합니다. 따라서 더 긴 개입 기간 후에 구성을 분석하고 이를 임상 결과와 연관시킨 연구는 단 하나뿐입니다.

목표:

이 연구의 목적은 치은 염증 및 치은열구액(GCF)에서 선택된 염증 유발 및 항염증 사이토카인의 수준에 대한 프로바이오틱 후보 균주를 포함하는 정제의 효과를 조사하는 것입니다. 두 번째 목표는 타액 미생물에 대한 정제의 효과를 설명하는 것입니다. 귀무 가설은 임상 측정, 사이토카인 수준 및 타액의 미생물 구성이 기준선과 또는 연구 그룹과 대조군 간에 다르지 않을 것이라는 것입니다.

연구 설계:

연구는 이중 맹검으로 계획됩니다. 2개의 평행 암을 사용한 위약 대조 무작위 시험. 개입 기간은 4주로 예정되어 있습니다. 연구 계획은 윤리적 승인을 위해 제출됩니다.

재료:

참가자는 치과대학 클리닉의 환자 중에서 www.forsogsperson.dk를 통해 모집됩니다. 사전 동의 후 80명의 참가자를 등록한 다음 프로바이오틱 그룹 또는 위약 그룹에 무작위로 할당할 계획입니다. 샘플 크기는 이전에 얻은 BOP 값을 기반으로 전력 분석(α=0.05 및 β=0.2)에 의해 결정되었습니다. 74명의 참가자가 필요하며 예상되는 탈락자를 보상하기 위해 80명이 등록됩니다.

모집: 참가자가 연구에 대한 공지를 읽은 후 연구에 대한 관심을 표명하면 조교수이자 치과의사인 Mette Kirstine Keller와의 정보 약속에 초대됩니다. 약속 전에 참가자는 정보 회의에 동반자를 동반할 권리가 있음을 알립니다. 그들은 또한 연구에 대한 서면 정보를 받게 됩니다. 약속은 구도자, 참가자 및 가능하면 동반자 외에 다른 사람이 없는 회의실에서 이루어집니다. 구두 정보는 서면 정보를 기반으로 하며 가치가 있는 용어 없이 평이한 언어로 제공됩니다. 조사관은 프로젝트가 시작되기 전에 참가자가 주어진 모든 정보를 이해했는지 확인할 책임이 있습니다. 참가자의 모든 의견은 정보 인터뷰와 연구 중에 관련 고려 사항으로 간주됩니다. 참가자는 언제든지 프로젝트에서 철회할 수 있습니다. 시험 참여에 대한 사전 동의는 구두 및 서면 정보를 기반으로 하며, 이러한 동의는 최소 24시간의 숙고 시간 후에 제공될 수 있습니다. 이 프로젝트에는 신체적 또는 정신적 장애로 인해 정보에 입각한 동의를 할 수 없는 피험자는 포함되지 않습니다.

행동 양식:

간섭:

정보에 입각한 동의, 기본 검사 및 샘플링 후 참가자는 연구 그룹 중 하나에 무작위로 할당되고 프로바이오틱 정제 또는 위약 정제가 제공됩니다.

프로바이오틱 정제에는 1 * 109 CFU/정의 용량으로 Lactobacillus rhamnosus PB01 및 Lactobacillus curvatus P2-2가 포함되어 있습니다. 균주는 병원체의 성장 억제 및 면역 조절을 조사하는 시험관 내 분석을 기반으로 선택됩니다. 위약 정제는 크기와 구성이 동일하지만 프로바이오틱스 균주가 추가되지 않았습니다. 두 정제 모두 Bifodan A/S에서 제공합니다. 참여자들은 양치질 후 30분 후에 아침과 저녁에 각각 1정을 복용하도록 지시받을 것입니다. 정제는 색상 코딩으로 동일한 냄비에 포장됩니다. 코드는 분석이 완료될 때까지 조사자가 보관하지 않습니다.

참가자들은 4주 동안 하루에 두 알씩 복용하게 됩니다. 후속 등록은 2주, 4주 및 6주 후에 수행됩니다.

임상 절차:

방문할 때마다 타액과 GCF(Gingival Crevicular Fluid)를 수집한 다음 플라크 지수(PI) 및 프로빙 시 출혈(BOP)을 등록합니다. GCF 수집을 위해 각 참가자로부터 상악 절치, 송곳니 또는 소구치에서 반대측 협측 부위 2개를 선택합니다. 선택한 치아의 시각적인 치은연 플라크를 제거하고 해당 부위를 면봉으로 건조시킵니다. GCF는 20초 동안 잇몸 고랑에 부드럽게 삽입된 종이주위 스트립(ProFlow, Amityville, NY, USA)을 사용하여 수집됩니다. 스트립의 위치는 후속 조치에서 동일한 샘플 사이트를 확보하기 위해 차트에 표시됩니다. 혈액 오염의 경우 스트립을 배출하고 5분 후에 샘플링을 반복합니다. GCF의 부피는 Peritron 8000(Proflow)을 사용하여 기록하고 μL로 표시합니다. 하나의 스트립은 약 0.1-0.4를 보유합니다. μL GCF. 그런 다음 스트립을 플라스틱 튜브로 옮기고 추가 분석까지 -80ºC에서 보관합니다.

타액 샘플의 경우 음식 섭취 후 최소 2시간 후 3분 동안 파라핀으로 자극된 전체 타액을 수집합니다. 정상적인 속도에서 침의 대략적인 양은 3분 후에 3-6ml가 됩니다. 수집된 타액은 1.5ml 분취량으로 즉시 동결되고 추가 분석이 있을 때까지 -80ºC에서 보관됩니다. 나머지 샘플은 연구 완료 후 파기됩니다.

실험실 절차:

GCF 상의 사이토카인 분석: 흡수된 GCF는 0.05% Tween 20이 포함된 120 μL PBS(phosphate buffered saline)에 용출됩니다. INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 및 IL-12의 수준은 제조자의 매뉴얼에 따라 루미넥스 및 다중 면역분석 패널(LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA)을 사용하여 측정하였다. 사이토카인의 농도는 pg/ml로 표시됩니다.

타액 마이크로바이옴의 분석: 계통 발생 마커 유전자 16S rRNA의 앰플리콘 시퀀싱을 통해 두 실험 그룹에서 전체 미생물 군집의 구성 및 안정성을 식별하고 비교하기 위해 해동된 타액 샘플 2ml에서 총 박테리아 DNA를 추출합니다. 박테리아 및 고세균 16S rRNA 유전자의 초가변 영역 V3-V4는 특정 프라이머 341F 및 806R을 사용하여 PCR 증폭되고 코펜하겐 대학 미생물학 파트너가 최신 기술을 기반으로 개발한 확립된 고처리량 시퀀싱 파이프라인으로 분석됩니다. 시퀀싱 기술(Illumina Mi-Seq) 및 대규모 마이크로바이옴 데이터 세트 분석을 위해 특별히 설계된 맞춤형 생물 정보 도구.

통계적 방법:

모든 데이터는 SPSS 소프트웨어(v 22.0; Chicago, Ill, USA)로 처리됩니다. 후속 값은 Wilcoxon paired two-sided test에 의해 각 그룹 내 기준선과 비교되고 그룹 간의 차이는 Wilcoxon unpaired test에 의해 분석됩니다. p-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

데이터 관리:

수집된 모든 데이터는 개인 데이터 처리에 관한 법률 및 "보건법"에 따라 처리됩니다. 포함 시 참가자에게는 개인 식별 번호가 없는 고유 번호와 별도의 프로토콜이 할당됩니다.

과학적 중요성:

이 연구는 프로바이오틱 정제가 치은 염증 및/또는 염증 유발 및 항염증 사이토카인의 임상 지표에 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공할 수 있으며, 이는 치은염을 관리하고 구강 건강을 유지하는 새로운 전략으로 이어질 수 있습니다. 치과 질환 치료에 프로바이오틱 박테리아를 사용하는 것은 항생제 사용의 한 가지 옵션이 될 수 있습니다. 또한 그것은 세균 요법에서 중요한 사건으로 여겨지는 타액 미생물 군집에 새로운 변종을 도입하는 효과에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것입니다.

위험 및 역효과:

참가자는 연구 기간 동안 시험 참가자에게 발생한 모든 손상을 보장하는 The School of Dentistry의 환자 보험에 의해 전액 보장됩니다. 프로바이오틱스 치료에 예상되는 부작용은 없습니다. 프로바이오틱스는 유럽식품안전청(EFSA)에서 일반적으로 안전한 것으로 간주됩니다(GRAS: 일반적으로 안전하다고 인정됨).

참가자는 예상치 못한 부작용을 보고해야 합니다.

윤리적 고려 사항:

참가자는 치료로부터 직접적인 혜택을 받지 못하지만, 연구에서 얻은 지식은 구강 내 미생물 유래 질병의 예방에 기여할 수 있습니다. 앞으로 충치와 치주염. 샘플 수집은 참가자에게 불편함을 유발하지 않으며 태블릿에는 알려진 부작용이 없습니다. 따라서 참가자의 개인적 이익은 참가자의 최소한의 위험과 불편에 해당합니다. 평가판을 완료한 참가자에게는 Magasin에 500 DKK의 상품권이 보상됩니다. 긍정적, 부정적, 결정적이지 않은 결과가 발표될 것임을 강조해야 합니다.

시간표:

연구 준비는 2014/2015 겨울에 수행됩니다. 윤리적 승인 후 환자는 2015년 겨울/봄 동안 연구에 모집될 수 있습니다.