Virkninger på tabletter, der indeholder probiotiske kandidatstammer

Baggrund:

Det menneskelige spyt giver en let tilgængelig og ikke-invasiv mulighed for at studere bakterielle interaktioner samt biomarkører for sundhed og sygdom. Human Microbiome Project har givet indsigt i, at biofilmene i og uden for vores kroppe har udviklet sig sammen med menneskeheden og spiller en vigtig rolle for sundheden. Dette gælder også for mundhulen, hvor mikrobiotaen ikke spiller en passiv rolle, men aktivt bidrager til opretholdelsen af ​​mundsundheden. Men visse økologiske skift i mikrobiomet tillader patogener at manifestere sig og forårsage orale sygdomme. Ifølge den økologiske plaque-hypotese er caries og paradentose resultatet af miljøfremkaldt overvækst af henholdsvis sure og proteolytiske arter.

Bakterioterapi er det udtryk, der bruges, når en harmløs effektorstamme implanteres i værtens mikroflora for at opretholde eller genoprette et naturligt mikrobiom ved interferens og/eller hæmning af andre mikroorganismer, og især patogener. Dette kan åbne op for alternative måder at bekæmpe infektionssygdomme med mindre skadelige bivirkninger og kan også hjælpe i behandlingen af ​​lidelser, der ikke ser ud til at have noget at gøre med bakterier, såsom astma, fedme og diabetes. Probiotiske bakterier, defineret som "Levende mikroorganismer, som, når de administreres i passende mængder, giver en sundhedsmæssig fordel for værten" (WHO), er almindeligt foreslåede kandidater til bakterioterapi. De potentielle virkningsmekanismer er stadig ikke fuldt ud forstået, men det synes klart, at der er lokale (direkte) såvel som systemiske (indirekte) effekter. Ifølge Reid er de potentielle veje: i) co-aggregering med patogener og væksthæmning, ii) produktion af bakteriocin og hydrogenperoxid, iii) konkurrencemæssig udelukkelse gennem antagonistiske aktiviteter på adhæsionssteder og ernæring, iv) systemisk immunmodulering.

In vitro undersøgelser har vist effekt på co-aggregering og væksthæmning, og kliniske undersøgelser har vist effekt på kliniske parametre for gingival inflammation, men der er stadig lidt kendt om den immunmodulerende effekt og vært-mikrobe interaktion.

Paradentose er blandt de mest udbredte infektionssygdomme hos mennesker og kan føre til tandtab. Hvis den ikke behandles, kan tandkødsbetændelse føre til paradentose.

De forskellige overflader af mundhulen er alle kontinuerligt badet i spyt, og flere patogene arter i spyt er blevet forbundet med paradentose. Undersøgelser af probiotiske bakteriers mikrobielle effekt på oral sundhed har hidtil været baseret på konventionelle dyrkningsmetoder og har været fokuseret på en eller få stammer. De nye high-throughput-teknikker giver mulighed for et mere omfattende og præcist billede af bakterieprofilerne, men til dato har kun få studier brugt sekventering til at bestemme den bakterielle sammensætning af spyt efter indtagelse af probiotiske bakterier. De fleste analyserer sammensætningen efter et meget kortvarigt indtag af de probiotiske bakterier. Derfor er der kun én undersøgelse, som har analyseret sammensætningen efter længere interventionsperiode og korreleret dette med kliniske resultater.

Sigte:

Formålet med undersøgelsen er at undersøge effekten af ​​tabletter, der indeholder probiotiske kandidatstammer, på tandkødsbetændelse og niveauet af udvalgte pro- og antiinflammatoriske cytokiner i tandkødscrevikulær væske (GCF). Et sekundært formål er at beskrive tabletternes effekt på spytmikrobiomet. Nulhypotesen er, at de kliniske målinger, niveauer af cytokiner og mikrobiel sammensætning af spyt ikke vil afvige fra baseline eller mellem undersøgelses- og kontrolgruppen.

Studere design:

Undersøgelsen er planlagt som en dobbeltblind; placebokontrolleret randomiseret forsøg med to parallelle arme. Interventionsperioden er planlagt til at være 4 uger. Studieplanen vil blive forelagt til etisk godkendelse.

Materiale:

Deltagerne vil blive rekrutteret blandt patienter på klinikken på Tandlægeskolen og gennem www.forsogsperson.dk. 80 deltagere er planlagt til at blive tilmeldt efter informeret samtykke og derefter tilfældigt fordelt til enten probiotikagruppen eller placebogruppen. Prøvestørrelse blev bestemt ved en effektanalyse (α=0,05 og β=0,2) baseret på værdier af BOP opnået tidligere. Der er brug for 74 deltagere, og 80 er tilmeldt for at kompensere for forventet frafald.

Rekruttering: Hvis deltagerne efter at have læst opslaget om undersøgelsen udtrykker interesse for undersøgelsen, vil de blive inviteret til en informationssamtale med adjunkt og tandlæge Mette Kirstine Keller. Forud for aftalen vil deltagerne blive informeret om, at de har ret til at medbringe en ledsager til informationsmødet. De vil også modtage den skriftlige information om undersøgelsen. Aftalen vil foregå i et mødelokale uden andre tilstede end efterforsker, deltager og eventuelt ledsager. Den mundtlige information vil være baseret på den skriftlige information og vil blive givet i et almindeligt sprog uden værdiladede udtryk. Efterforskeren er ansvarlig for at sikre, at deltageren har forstået alle givne oplysninger, inden projektet påbegyndes. Alle kommentarer fra deltageren tages i relevant overvejelse både under informationssamtalen og undersøgelsen. Deltageren kan til enhver tid trække sig fra projektet. Det informerede samtykke til deltagelse i forsøget gives på baggrund af mundtlig og skriftlig information, og et sådant samtykke kan gives efter mindst 24 timers betænkningstid. Projektet omfatter ikke forsøgspersoner, der på grund af fysisk eller psykisk handicap ikke kan give det informerede samtykke.

Metoder:

Intervention:

Efter informeret samtykke, baseline-undersøgelse og prøveudtagning fordeles deltagerne tilfældigt i en af ​​undersøgelsesgrupperne og udleveres enten probiotiske tabletter eller placebotabletter.

De probiotiske tabletter indeholder Lactobacillus rhamnosus PB01 og Lactobacillus curvatus P2-2 i en dosis på 1 * 109 CFU/tablet. Stammerne er valgt baseret på in vitro-assays, der undersøger væksthæmning af patogener og immunmodulering. Placebotabletterne er identiske i størrelse og sammensætning, men uden tilsætning af de probiotiske stammer. Begge tablets leveres af Bifodan A/S. Deltagerne vil blive instrueret i at tage en tablet om morgenen og en om aftenen 30 minutter efter tandbørstning. Tabletterne er pakket i identiske gryder med farvekoder. Koden vil blive opbevaret fra efterforskerne, indtil analysen er færdig.

Deltagerne vil tage to tabletter om dagen i fire uger. Opfølgende registreringer foretages efter to uger, fire uger og seks uger.

Kliniske procedurer:

Ved hvert besøg vil spyt og GCF (Gingival Crevicular Fluid) blive opsamlet, og derefter vil plakindeks (PI) og blødning ved sondering (BOP) blive registreret. Til indsamling af GCF vil to kontralaterale bukkale steder fra de øvre fortænder, hjørnetænder eller præmolarer blive udvalgt fra hver deltager. Visuel supragingival plak på de valgte tænder vil blive fjernet, og stederne vil blive tørret med bomuldspellets. GCF vil blive opsamlet ved hjælp af periopaper-strimler (ProFlow, Amityville, NY, USA) forsigtigt indsat i tandkødssulcus i 20 s. Positionen af ​​strimlen er markeret på et diagram for at sikre det identiske prøvested ved opfølgningerne. Ved blodkontaminering udtømmes strimlen og prøvetagningen gentages efter 5 min. Volumenet af GCF registreres ved hjælp af en Peritron 8000 (Proflow) og udtrykt i μL. En strimmel rummer ca. 0,1-0,4 μL GCF. Strimlerne overføres derefter til plastrør og opbevares ved -80ºC indtil videre analyse.

Til spytprøverne opsamles paraffinstimuleret hel spyt i løbet af en 3-minutters periode mindst to timer efter enhver fødeindtagelse. Den omtrentlige mængde spyt ved normal hastighed vil være 3-6 ml efter 3 minutter. Det opsamlede spyt fryses straks i 1,5 ml alikvoter og opbevares ved -80ºC indtil videre analyse. Resten af ​​prøven vil blive destrueret efter afslutning af undersøgelsen.

Laboratorieprocedurer:

Analyse af cytokiner på GCF: Den absorberede GCF elueres i 120 μL PBS (phosphatbufret saltvand) indeholdende 0,05 % Tween 20. Niveauerne af INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 og IL-12 bestemmes ved hjælp af luminex og multiplex immunoassaypaneler (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) i overensstemmelse med producentens manual. Koncentrationerne af cytokinerne er udtrykt som pg/ml.

Analyse af spytmikrobiomet: Totalt bakterielt DNA vil blive ekstraheret fra 2 ml optøet spytprøve til identifikation og sammenligning af sammensætningen og stabiliteten af ​​de totale mikrobielle samfund i de to forsøgsgrupper gennem amplikonsekventering af det fylogenetiske markørgen 16S rRNA. Den hypervariable region V3-V4 af bakterielle og arkæale 16S rRNA-gener vil blive PCR-amplificeret ved hjælp af specifikke primere 341F og 806R og analyseret af en etableret high-throughput sekventeringspipeline udviklet af Københavns Universitets mikrobiologipartner baseret på state-of-the-art sekventeringsteknologier (Illumina Mi-Seq) og specialfremstillede bioinformatiske værktøjer specielt designet til analyse af store mikrobiomdatasæt.

Statistiske metoder:

Alle data vil blive behandlet med SPSS-software (v 22.0; Chicago, Ill, USA). Opfølgningsværdierne sammenlignes med baseline inden for hver gruppe ved Wilcoxon parret tosidet test, og forskelle mellem grupperne analyseres ved Wilcoxon uparret test. En p-værdi < 0,05 anses for statistisk signifikant.

Datastyring:

Alle indsamlede data vil blive behandlet i overensstemmelse med lov om behandling af personoplysninger og "Sundhedsloven". Ved optagelse vil deltagerne få tildelt et unikt nummer og en separat protokol uden personnummer.

Videnskabelig betydning:

Undersøgelsen kan give bevis for, at de probiotiske tabletter kan påvirke kliniske markører for tandkødsbetændelse og/eller pro- og antiinflammatoriske cytokiner, hvilket kan føre til nye strategier til at håndtere tandkødsbetændelse og opretholde oral sundhed. Brugen af ​​probiotiske bakterier til behandling af tandsygdomme kunne være en mulighed for brugen af ​​antibiotika. Desuden vil det give ny indsigt i effekten af ​​at introducere nye stammer til spytmikrobiomet, som formodes at være en væsentlig begivenhed i bakterioterapi.

Risici og negative virkninger:

Deltagerne er fuldt ud dækket af Tandlægeskolens patientforsikring, som dækker eventuelle skader på forsøgsdeltageren under undersøgelsen. Der forventes ingen bivirkninger ved behandlingen med probiotika. Probiotika anses generelt for sikre (GRAS: Generally Recognized As Safe) af Den Europæiske Fødevaresikkerhedsautoritet (EFSA).

Deltagerne vil blive bedt om at rapportere alle uventede bivirkninger.

Etiske overvejelser:

Deltagerne vil ikke have direkte gavn af behandlingen, men den viden opnået fra undersøgelsen kan bidrage til at forebygge mikrobielle sygdomme i munden, f.eks. caries og paradentose, i fremtiden. Prøveindsamlingen forårsager ikke ubehag for deltagerne, og tabletterne har ingen kendte bivirkninger. Derfor svarer deltagernes personlige udbytte til den minimale risiko og ubehag for deltagerne. De deltagere, der gennemfører forsøget, bliver kompenseret med et gavekort på 500 kr. til Magasin. Det skal understreges, at positive, negative og inkonklusive resultater vil blive offentliggjort.

Tidsplan:

Udarbejdelse af undersøgelsen vil blive udført i vinteren 2014/2015. Efter etisk godkendelse kan patienter rekrutteres til undersøgelsen i løbet af vinteren/foråret 2015.