Effecten op tabletten die probiotische kandidaat-stammen bevatten

Achtergrond:

Het menselijk speeksel biedt een gemakkelijk toegankelijke en niet-invasieve mogelijkheid om bacteriële interacties en biomarkers van gezondheid en ziekte te bestuderen. Het Human Microbiome Project heeft inzichten opgeleverd dat de biofilms binnen en buiten ons lichaam samen met de mensheid zijn geëvolueerd en een belangrijke rol spelen voor de gezondheid. Dit geldt ook voor de mondholte waarin de microbiota geen passieve rol speelt maar actief bijdraagt ​​aan het behoud van de mondgezondheid. Bepaalde ecologische verschuivingen in het microbioom zorgen er echter voor dat ziekteverwekkers zich kunnen manifesteren en orale ziekten kunnen veroorzaken. Volgens de ecologische plaquehypothese zijn cariës en parodontitis het resultaat van door de omgeving veroorzaakte overgroei van respectievelijk zure en proteolytische soorten.

Bacteriotherapie is de term die wordt gebruikt wanneer een onschadelijke effectorstam wordt geïmplanteerd in de microflora van de gastheer om een ​​natuurlijk microbioom te behouden of te herstellen door interferentie en/of remming van andere micro-organismen, en vooral pathogenen. Dit kan alternatieve manieren openen om infectieziekten met minder schadelijke bijwerkingen te bestrijden en kan ook helpen bij de behandeling van aandoeningen die niets met bacteriën te maken lijken te hebben, zoals astma, obesitas en diabetes. Probiotische bacteriën, gedefinieerd als "Levende micro-organismen die, wanneer ze in voldoende hoeveelheden worden toegediend, een gezondheidsvoordeel opleveren voor de gastheer" (WHO), zijn vaak voorgestelde kandidaten voor bacteriotherapie. De mogelijke werkingsmechanismen worden nog steeds niet volledig begrepen, maar het lijkt duidelijk dat er zowel lokale (directe) als systemische (indirecte) effecten zijn. Volgens Reid zijn de mogelijke wegen: i) co-aggregatie met pathogenen en groeiremming, ii) productie van bacteriocine en waterstofperoxide, iii) competitieve uitsluiting door antagonistische activiteiten op adhesieplaatsen en voeding, iv) systemische immunomodulatie.

In vitro studies hebben effect op co-aggregatie en groeiremming aangetoond en klinische studies hebben effect op klinische parameters van tandvleesontsteking aangetoond, maar er is nog weinig bekend over het immunomodulerende effect en de gastheer-microbe-interactie.

Parodontitis behoort tot de meest voorkomende infectieziekten bij de mens en kan leiden tot tandverlies. Indien onbehandeld, kan gingivitis leiden tot parodontitis.

De verschillende oppervlakken van de mondholte baden allemaal continu in speeksel en verschillende pathogene soorten in speeksel zijn in verband gebracht met parodontitis. Studies naar het microbiële effect van probiotische bacteriën op de mondgezondheid zijn tot nu toe gebaseerd op conventionele kweekmethoden en gericht op één of enkele stammen. De nieuwe high-throughput-technieken bieden een mogelijkheid voor een uitgebreider en nauwkeuriger beeld van de bacterieprofielen, maar tot op heden hebben slechts enkele studies sequencing gebruikt om de bacteriële samenstelling van speeksel na inname van probiotische bacteriën te bepalen. De meesten analyseren de samenstelling na een zeer korte inname van de probiotische bacteriën. Daarom is er slechts één studie die de samenstelling na een langere interventieperiode heeft geanalyseerd en deze heeft gecorreleerd aan klinische uitkomsten.

Doel:

Het doel van de studie is om het effect te onderzoeken van tabletten die probiotische kandidaat-stammen bevatten, op gingivale ontsteking en de niveaus van geselecteerde pro- en anti-inflammatoire cytokines in gingivale creviculaire vloeistof (GCF). Een secundair doel is om het effect van de tabletten op het speekselmicrobioom te beschrijven. De nulhypothese is dat de klinische metingen, niveaus van cytokines en microbiële samenstelling van speeksel niet zullen verschillen van de basislijn of tussen de onderzoeks- en controlegroep.

Studie ontwerp:

De studie is gepland als dubbelblind; placebogecontroleerde gerandomiseerde studie met twee parallelle armen. De geplande interventieperiode is 4 weken. Het studieplan wordt ter ethische goedkeuring voorgelegd.

Materiaal:

De deelnemers worden geworven onder patiënten in de kliniek van de School of Dentistry en via www.forsogsperson.dk. Het is de bedoeling dat 80 deelnemers worden ingeschreven na geïnformeerde toestemming en vervolgens willekeurig worden toegewezen aan de probiotische groep of de placebogroep. De steekproefomvang werd bepaald door een poweranalyse (α= 0,05 en β=0,2) op basis van eerder verkregen waarden van BOP. Er zijn 74 deelnemers nodig en 80 zijn ingeschreven om de verwachte uitval te compenseren.

Werving: Indien de deelnemers na het lezen van het bericht over het onderzoek interesse tonen in het onderzoek worden zij uitgenodigd voor een informatieafspraak met universitair docent en tandarts Mette Kirstine Keller. Voorafgaand aan de afspraak worden de deelnemers geïnformeerd dat zij het recht hebben om een ​​begeleider mee te nemen naar de informatiebijeenkomst. Ook ontvangen zij de schriftelijke informatie over het onderzoek. De afspraak vindt plaats in een vergaderruimte zonder andere aanwezigen dan de onderzoeker, de deelnemer en eventueel een begeleider. De mondelinge informatie is gebaseerd op de schriftelijke informatie en wordt gegeven in begrijpelijke taal zonder waardebeladen termen. De onderzoeker is ervoor verantwoordelijk dat de deelnemer alle gegeven informatie heeft begrepen voordat het project begint. Alle opmerkingen van de deelnemer worden zowel tijdens het informatiegesprek als tijdens het onderzoek relevant in overweging genomen. De deelnemer kan zich op elk moment terugtrekken uit het project. De geïnformeerde toestemming voor deelname aan het onderzoek wordt gegeven op basis van mondelinge en schriftelijke informatie en deze toestemming kan worden gegeven na minimaal 24 uur bedenktijd. Het project omvat geen proefpersonen die vanwege een lichamelijke of geestelijke handicap geen geïnformeerde toestemming kunnen geven.

methoden:

Interventie:

Na geïnformeerde toestemming, basisonderzoek en bemonstering, worden de deelnemers willekeurig toegewezen aan een van de studiegroepen en krijgen ze probiotische tabletten of placebo-tabletten.

De probiotische tabletten bevatten Lactobacillus rhamnosus PB01 en Lactobacillus curvatus P2-2 in een dosering van 1 * 109 CFU/tablet. De stammen worden gekozen op basis van in vitro assays die groeiremming van pathogenen en immunomodulatie onderzoeken. De placebotabletten zijn qua grootte en samenstelling identiek, maar zonder de toevoeging van de probiotische stammen. Beide tabletten worden geleverd door Bifodan A/S. De deelnemers krijgen de instructie om 's ochtends één tablet en één 's avonds dertig minuten na het tandenpoetsen in te nemen. De tabletten zijn verpakt in identieke potjes met kleurcodering. De code wordt bewaard voor de onderzoekers totdat de analyse is voltooid.

Vier weken lang slikken de deelnemers twee tabletten per dag. Vervolgregistraties vinden plaats na twee weken, vier weken en zes weken.

Klinische procedures:

Bij elk bezoek worden speeksel en GCF (Gingival Crevicular Fluid) verzameld en vervolgens worden plaque-index (PI) en bloeding bij sonderen (BOP) geregistreerd. Voor het verzamelen van GCF worden van elke deelnemer twee contralaterale buccale plaatsen van de bovenste snijtanden, hoektanden of premolaren geselecteerd. Visuele supragingivale plaque op de geselecteerde tanden wordt verwijderd en de plaatsen worden gedroogd met wattenbolletjes. GCF wordt verzameld met behulp van periopaper-strips (ProFlow, Amityville, NY, VS) die gedurende 20 seconden voorzichtig in de gingivale sulcus worden ingebracht. De positie van de strip is gemarkeerd op een kaart om de identieke monsterplaats bij de follow-ups te beveiligen. In geval van bloedbesmetting wordt de strip afgevoerd en wordt de bemonstering na 5 minuten herhaald. Het volume van GCF wordt geregistreerd met behulp van een Peritron 8000 (Proflow) en uitgedrukt in μL. Een strip bevat ongeveer 0,1-0,4 μL GCF. De strips worden vervolgens overgebracht naar plastic buizen en bewaard bij -80ºC tot verdere analyse.

Voor de speekselmonsters wordt paraffine-gestimuleerd volledig speeksel verzameld gedurende een periode van 3 minuten, ten minste twee uur na voedselinname. De geschatte hoeveelheid speeksel bij normale snelheid zal na 3 minuten 3-6 ml zijn. Het verzamelde speeksel wordt onmiddellijk ingevroren in aliquots van 1,5 ml en bewaard bij -80°C tot verdere analyse. De rest van het monster wordt na voltooiing van het onderzoek vernietigd.

Laboratoriumprocedures:

Analyse van cytokinen op GCF: De geabsorbeerde GCF wordt geëlueerd in 120 μl PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) die 0,05% Tween 20 bevat. De niveaus van INFγ, TNF-α, IL-8, IL-10 en IL-12 worden bepaald met behulp van luminex en multiplex immunoassaypanelen (LINCOplex, LINCO Research, Inc, VS) in overeenstemming met de handleiding van de fabrikant. De concentraties van de cytokinen worden uitgedrukt als pg/ml.

Analyse van het speekselmicrobioom: totaal bacterieel DNA zal worden geëxtraheerd uit 2 ml ontdooid speekselmonster voor identificatie en vergelijking van de samenstelling en stabiliteit van de totale microbiële gemeenschappen in de twee proefgroepen door middel van ampliconsequencing van het fylogenetische merkergen 16S rRNA. Het hypervariabele gebied V3-V4 van bacteriële en archaeale 16S rRNA-genen zal PCR-geamplificeerd worden met behulp van specifieke primers 341F en 806R en geanalyseerd door een gevestigde high-throughput sequencing-pijplijn ontwikkeld door de microbiologische partner van de Universiteit van Kopenhagen op basis van state-of-the-art sequencing-technologieën (Illumina Mi-Seq) en op maat gemaakte bio-informatica-tools die speciaal zijn ontworpen voor analyse van grote microbioom-datasets.

Statistische methoden:

Alle gegevens worden verwerkt met SPSS-software (v 22.0; Chicago, Illinois, VS). De follow-upwaarden worden vergeleken met de basislijn binnen elke groep door de Wilcoxon-gepaarde tweezijdige test en de verschillen tussen de groepen worden geanalyseerd door de Wilcoxon-ongepaarde test. Een p-waarde < 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

Gegevensbeheer:

Alle verzamelde gegevens zullen worden behandeld in overeenstemming met de Wet Verwerking Persoonsgegevens en "De Gezondheidswet". Bij opname krijgen de deelnemers een uniek nummer en een apart protocol zonder persoonlijk identificatienummer.

Wetenschappelijk belang:

De studie kan bewijs leveren dat de probiotische tabletten klinische markers van tandvleesontsteking en/of pro- en anti-inflammatoire cytokines kunnen beïnvloeden, wat kan leiden tot nieuwe strategieën bij het beheersen van gingivitis en het behouden van de mondgezondheid. Het gebruik van probiotische bacteriën bij de behandeling van tandheelkundige aandoeningen kan een optie zijn voor het gebruik van antibiotica. Bovendien zal het nieuwe inzichten opleveren over het effect van het introduceren van nieuwe stammen in het speekselmicrobioom, wat een belangrijke gebeurtenis zou zijn in bacteriotherapie.

Risico's en bijwerkingen:

De deelnemers zijn volledig gedekt door de patiëntenverzekering van The School of Dentistry die eventuele schade aan de proefdeelnemer tijdens het onderzoek dekt. ​​Er zijn geen verwachte bijwerkingen van de behandeling met probiotica. Probiotica worden door de Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) over het algemeen als veilig beschouwd (GRAS: Algemeen erkend als veilig).

De deelnemers wordt gevraagd elk onverwacht nadelig effect te melden.

Ethische overwegingen:

De deelnemers zullen niet direct baat hebben bij de behandeling, maar de kennis die uit het onderzoek is opgedaan, kan bijdragen aan de preventie van door microben veroorzaakte ziekten in de mond, b.v. cariës en parodontitis, in de toekomst. De monsterverzameling veroorzaakt geen ongemak voor de deelnemers en de tabletten hebben geen bekende bijwerkingen. Daarom komt het persoonlijke voordeel van de deelnemers overeen met het minimale risico en ongemak voor de deelnemers. De deelnemers die de proef voltooien, worden gecompenseerd met een cadeaubon van 500 DKK aan Magasin. Benadrukt moet worden dat positieve, negatieve en onduidelijke resultaten zullen worden gepubliceerd.

Tijdschema:

De voorbereiding van het onderzoek vindt plaats in de winter 2014/2015. Na ethische goedkeuring kunnen patiënten in de winter/lente 2015 voor de studie worden geworven.