Vaikutukset probioottikandidaattikantoja sisältäviin tabletteihin

Tausta:

Ihmisen sylki tarjoaa helposti saatavilla olevan ja ei-invasiivisen mahdollisuuden tutkia bakteerien vuorovaikutusta sekä terveyden ja sairauden biomarkkereita. Ihmisen mikrobiomiprojekti on antanut oivalluksia siitä, että kehomme sisällä ja ulkopuolella olevat biofilmit ovat kehittyneet yhdessä ihmiskunnan kanssa ja niillä on tärkeä rooli terveydelle. Tämä pätee myös suuonteloon, jossa mikrobiotalla ei ole passiivista roolia, vaan se edistää aktiivisesti suun terveyden ylläpitämistä. Tietyt ekologiset muutokset mikrobiomissa sallivat kuitenkin patogeenien ilmaantua ja aiheuttaa suun sairauksia. Ekologisen plakin hypoteesin mukaan karies ja parodontiitti ovat seurausta ympäristön aiheuttamasta happamien ja proteolyyttisten lajien liikakasvusta.

Bakterioterapia on termi, jota käytetään, kun vaaraton efektorikanta istutetaan isännän mikroflooraan luonnollisen mikrobiomin ylläpitämiseksi tai palauttamiseksi häiritsemällä ja/tai estämällä muita mikro-organismeja ja erityisesti patogeenejä. Tämä saattaa avata vaihtoehtoisia tapoja torjua tartuntatauteja, joilla on vähemmän haitallisia sivuvaikutuksia, ja auttaa myös sellaisten sairauksien hoidossa, joilla ei näytä olevan mitään tekemistä bakteerien kanssa, kuten astma, liikalihavuus ja diabetes. Probioottiset bakteerit, jotka määritellään "eläviksi mikro-organismeiksi, jotka riittäviä määriä annettuna tuovat terveydellistä hyötyä isännälle" (WHO), ovat yleisesti ehdotettuja kandidaatteja bakterioterapiaan. Mahdollisia vaikutusmekanismeja ei vielä täysin ymmärretä, mutta näyttää selvältä, että niillä on paikallisia (suoria) kuin systeemisiä (epäsuoraa) vaikutuksia. Reidin mukaan mahdolliset keinot ovat: i) yhteisaggregaatio patogeenien kanssa ja kasvun esto, ii) bakteriosiinin ja vetyperoksidin tuotanto, iii) kilpaileva poissulkeminen antagonististen aktiivisuuksien kautta adheesiokohtiin ja ravitsemukseen, iv) systeeminen immunomodulaatio.

In vitro -tutkimukset ovat osoittaneet vaikutusta yhteisaggregaatioon ja kasvun estoon, ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet vaikutusta ientulehduksen kliinisiin parametreihin, mutta immunomoduloivasta vaikutuksesta ja isännän ja mikrobien vuorovaikutuksesta tiedetään vielä vähän.

Parodontaaliset sairaudet ovat ihmisten yleisimpiä tartuntatauteja ja voivat johtaa hampaiden menetykseen. Hoitamattomana ientulehdus voi johtaa parodontiittiin.

Kaikki suuontelon eri pinnat kylpevät jatkuvasti syljessä, ja useita syljen patogeenisiä lajeja on liitetty parodontaaliin. Tutkimukset probioottisten bakteerien mikrobivaikutuksista suun terveyteen ovat toistaiseksi perustuneet perinteisiin viljelymenetelmiin ja keskittyneet yhteen tai muutamaan kantaan. Uudet tehokkaat tekniikat tarjoavat mahdollisuuden kattavampaan ja tarkempaan kuvaan bakteeriprofiileista, mutta tähän mennessä vain muutamassa tutkimuksessa on käytetty sekvensointia syljen bakteerikoostumuksen määrittämiseen probioottisten bakteerien saannin jälkeen. Useimmat analysoivat koostumuksen hyvin lyhyen probioottisten bakteerien saannin jälkeen. Siksi on vain yksi tutkimus, joka on analysoinut koostumusta pidemmän interventiojakson jälkeen ja korreloinut tämän kliinisiin tuloksiin.

Tavoite:

Tutkimuksen tavoitteena on selvittää probioottikandidaattikantoja sisältävien tablettien vaikutusta ientulehdukseen sekä valittujen pro- ja anti-inflammatoristen sytokiinien pitoisuuksiin iensienessä (GCF). Toissijaisena tavoitteena on kuvata tablettien vaikutusta syljen mikrobiomiin. Nollahypoteesi on, että kliiniset mittaukset, sytokiinien tasot ja syljen mikrobikoostumus eivät eroa lähtötasosta tai tutkimus- ja kontrolliryhmän välillä.

Opintojen suunnittelu:

Tutkimus on suunniteltu kaksoissokkoutetuksi; lumekontrolloitu satunnaistettu tutkimus kahdella rinnakkaisella haaralla. Interventiojaksoksi on suunniteltu 4 viikkoa. Tutkimussuunnitelma toimitetaan eettisesti hyväksyttäväksi.

Materiaali:

Osallistujat rekrytoidaan Hammaslääketieteen korkeakoulun klinikan potilaiden joukosta ja www.forsogsperson.dk:n kautta. 80 osallistujaa suunnitellaan ilmoittautuvan tietoisen suostumuksen jälkeen ja jaettava satunnaisesti joko probioottiryhmään tai lumelääkeryhmään. Näytteen koko määritettiin tehoanalyysillä (a = 0,05 ja β = 0,2) aiemmin saatujen BOP-arvojen perusteella. Tarvitaan 74 osallistujaa ja 80 osallistujaa korvataan odotettavissa olevien keskeytysten korvaamiseksi.

Rekrytointi: Jos osallistujat ovat lukemisen jälkeen kiinnostuneita tutkimuksesta, heidät kutsutaan tiedotustilaisuuteen apulaisprofessori ja hammaslääkäri Mette Kirstine Kellerin kanssa. Ennen ajanvarausta osallistujille ilmoitetaan, että heillä on oikeus tuoda tiedotustilaisuuteen seuralainen. He saavat myös kirjalliset tiedot tutkimuksesta. Tapaaminen tapahtuu kokoushuoneessa ilman muita henkilöitä kuin tutkija, osallistuja ja mahdollisesti seuralainen. Suulliset tiedot perustuvat kirjallisiin tietoihin ja ne annetaan selkeällä kielellä ilman arvokkaita termejä. Tutkija vastaa siitä, että osallistuja on ymmärtänyt kaikki antamansa tiedot ennen projektin alkamista. Kaikki osallistujan kommentit otetaan asiaankuuluvasti huomioon sekä tietohaastattelussa että tutkimuksessa. Osallistuja voi milloin tahansa vetäytyä projektista. Tietoinen suostumus tutkimukseen osallistumiseen annetaan suullisen ja kirjallisen tiedon perusteella, ja suostumus voidaan antaa vähintään 24 tunnin harkinta-ajan jälkeen. Hankkeessa ei ole mukana henkilöitä, jotka fyysisen tai henkisen vamman vuoksi eivät voi antaa tietoista suostumusta.

Menetelmät:

Interventio:

Tietoisen suostumuksen, lähtötilanteen tutkimuksen ja näytteenoton jälkeen osallistujat jaetaan satunnaisesti yhteen tutkimusryhmistä ja heille annetaan joko probioottitabletteja tai lumetabletteja.

Probioottitabletit sisältävät Lactobacillus rhamnosus PB01:tä ja Lactobacillus curvatus P2-2:ta annoksena 1 * 109 CFU/tabletti. Kannat valitaan perustuen in vitro -määrityksiin, joissa tutkitaan patogeenien kasvun estoa ja immunomodulaatiota. Plasebotabletit ovat kooltaan ja koostumukseltaan samanlaisia, mutta niihin ei ole lisätty probioottikantoja. Molemmat tabletit toimittaa Bifodan A/S. Osallistujia neuvotaan ottamaan yksi tabletti aamulla ja yksi illalla 30 minuuttia hampaiden harjauksen jälkeen. Tabletit on pakattu identtisiin astioihin, joissa on värikoodi. Koodi säilytetään tutkijoilta, kunnes analyysi on valmis.

Osallistujat ottavat kaksi tablettia päivässä neljän viikon ajan. Seurantarekisteröinnit suoritetaan kahden, neljän ja kuuden viikon kuluttua.

Kliiniset toimenpiteet:

Jokaisella käynnillä kerätään sylkeä ja GCF (Gingival Crevicular Fluid), minkä jälkeen plakkiindeksi (PI) ja verenvuoto koettaessa (BOP) rekisteröidään. GCF-keräystä varten jokaiselta osallistujalta valitaan kaksi vastakkaista bukkaalista kohtaa ylemmistä etuhammista, kulmahampaasta tai esihammasta. Valituista hampaista poistetaan visuaalinen supragingivaalinen plakki ja kohdat kuivataan pumpulipelleteillä. GCF kerätään käyttämällä periopaperiliuskoja (ProFlow, Amityville, NY, USA), jotka työnnetään varovasti iensulkukseen 20 sekunnin ajan. Nauhan sijainti on merkitty kaavioon, jotta identtinen näytepaikka voidaan varmistaa seurannassa. Verikontaminaation sattuessa liuska poistetaan ja näytteenotto toistetaan 5 minuutin kuluttua. GCF:n tilavuus tallennetaan käyttämällä Peritron 8000:ta (Proflow) ja ilmaistaan ​​μl:na. Yksi liuska kestää noin 0,1-0,4 μL GCF. Liuskat siirretään sitten muoviputkiin ja säilytetään -80 ºC:ssa jatkoanalyysiin asti.

Sylkinäytteitä varten kerätään parafiinistimuloitua kokonaista sylkeä 3 minuutin aikana vähintään kahden tunnin ajan minkä tahansa ruoan nauttimisen jälkeen. Likimääräinen syljen määrä normaalinopeudella on 3-6 ml 3 minuutin kuluttua. Kerätty sylki pakastetaan välittömästi 1,5 ml:n erissä ja säilytetään -80 ºC:ssa jatkoanalyysiin asti. Loput näytteestä tuhotaan tutkimuksen päätyttyä.

Laboratoriotoimenpiteet:

Sytokiinien analyysi GCF:llä: Imeytynyt GCF eluoidaan 120 µl:ssa PBS:ää (fosfaattipuskuroitu suolaliuos), joka sisältää 0,05 % Tween 20:tä. INFy-, TNF-a-, IL-8-, IL-10- ja IL-12-tasot määritetään käyttämällä luminex- ja multiplex-immunomäärityspaneeleja (LINCOplex, LINCO Research, Inc, USA) valmistajan ohjeen mukaisesti. Sytokiinien pitoisuudet ilmaistaan ​​pg/ml:nä.

Syljen mikrobiomin analyysi: Bakteerien kokonais-DNA uutetaan 2 ml:sta sulatettua sylkinäytettä kaikkien mikrobiyhteisöjen koostumuksen ja stabiilisuuden tunnistamiseksi ja vertailua varten kahdessa koeryhmässä fylogeneettisen markkerigeenin 16S rRNA:n amplikonisekvensoinnin avulla. Bakteerien ja arkeisten 16S-rRNA-geenien hypervariaabeli alue V3-V4 monistetaan PCR:llä käyttämällä spesifisiä alukkeita 341F ja 806R ja analysoidaan Kööpenhaminan yliopiston mikrobiologian kumppanin kehittämällä korkean suorituskyvyn sekvensointiputkella. sekvensointiteknologiat (Illumina Mi-Seq) ja mittatilaustyönä tehdyt bioinformaattiset työkalut, jotka on suunniteltu erityisesti suurten mikrobiomitietosarjojen analysointiin.

Tilastolliset menetelmät:

Kaikki tiedot käsitellään SPSS-ohjelmistolla (v 22.0; Chicago, Ill, USA). Seurantaarvoja verrataan lähtötasoon kunkin ryhmän sisällä Wilcoxonin parillisen kaksipuolisen testin avulla ja ryhmien väliset erot analysoidaan Wilcoxonin parittomalla testillä. P-arvoa < 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevänä.

Tiedonhallinta:

Kaikki kerätyt tiedot käsitellään henkilötietojen käsittelystä annetun lain ja "terveyslain" mukaisesti. Osallistujille annetaan yksilöllinen numero ja erillinen protokolla ilman henkilötunnusta.

Tieteellinen merkitys:

Tutkimus voi tarjota todisteita siitä, että probioottitabletit voivat vaikuttaa ientulehduksen kliinisiin markkereihin ja/tai pro- ja anti-inflammatorisiin sytokiineihin, mikä voi johtaa uusiin strategioihin ientulehduksen hallinnassa ja suun terveyden ylläpitämisessä. Probioottisten bakteerien käyttö hammassairauksien hoidossa voisi olla yksi vaihtoehto antibioottien käyttöön. Lisäksi se tarjoaa uusia näkemyksiä uusien kantojen vaikutuksesta syljen mikrobiomiin, minkä oletetaan olevan merkittävä tapahtuma bakterioterapiassa.

Riskit ja haittavaikutukset:

Osallistujat ovat täysin katettu Hammaslääketieteen korkeakoulun potilasvakuutuksella, joka kattaa kaikki tutkimukseen osallistujalle tutkimuksen aikana aiheutuvat vahingot. Probioottihoidolla ei ole odotettavissa olevia sivuvaikutuksia. Euroopan elintarviketurvallisuusviranomainen (EFSA) pitää probiootteja yleisesti turvallisina (GRAS: yleisesti tunnustettu turvalliseksi).

Osallistujia pyydetään ilmoittamaan kaikista odottamattomista haittavaikutuksista.

Eettiset näkökohdat:

Osallistujat eivät hyödy suoraan hoidosta, mutta tutkimuksesta saatu tieto saattaa auttaa ehkäisemään mikrobiperäisiä suun sairauksia, mm. karies ja parodontiitti tulevaisuudessa. Näytteenotto ei aiheuta osallistujille epämukavuutta eikä tableteilla ole tunnettuja sivuvaikutuksia. Siksi osallistujien henkilökohtainen hyöty vastaa osallistujille mahdollisimman vähäistä riskiä ja epämukavuutta. Kokeen suorittaneet osallistujat saavat 500 DKK:n lahjakortin Magasinille. On syytä korostaa, että positiivisia, negatiivisia ja epäselviä tuloksia julkaistaan.

Aikataulu:

Selvityksen valmistelu toteutetaan talvella 2014/2015. Eettisen hyväksynnän jälkeen potilaat voidaan rekrytoida tutkimukseen talven/kevään 2015 aikana.