分岐鎖アミノ酸のインクレチン効果

研究プロトコル: 3 つのテストが別の機会に実施されました (間に少なくとも 7 日間)。 最初のテスト (IV BCAA テスト) は、BCAA 溶液 (Nutramin VLI 3%、Fresenius Kabi、KGaA、ドイツ; ロイシン 43%、イソロイシン 24%、バリン 33%) を 0.4 g/kg の総用量で IV 適用することで構成されます。 2時間の注入（平均溶液量1023±34.6mL、 BCAA の平均総投与量 30.7±1.1g) を使用して、推奨される最大注入速度を考慮してください。 2回目の試験（経口BCAA試験）は、0.4g/kg（平均BCAAの総量30.7±1.1g）を30秒間投与し、500mLの水道水で洗い流した。 3 番目の試験 (経口プラセボ試験) は、プラセボ カプセル (メチルセルロース、大学病院の調剤薬局が用意) を 0.4 g/kg の単回投与で 30 秒間経口摂取し、500 mL の水道水で洗い流すことで構成されます。 プラセボ カプセルの内容物は、BCAA カプセルと同じように重み付けされ、詰められていました。 参加者も、カプセルを管理し、プロトコルを実行するスタッフも、カプセルの内容について知らなかったので、無作為化された二重盲検設定が維持された可能性があります.

血液分析: 12 時間の絶食後 (～15 分) に各被験者から基礎末梢静脈血を採取し、その後 0、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240 分の時点で、介入。 血漿はすぐに分離され、すべてのサンプルは分析が行われるまで-80°Cで凍結されました。 GLP-1 および GIP 分析では、BD P800 採血システムを使用し、血液中の代謝ペプチドを保護するために開発されたコートを使用しました (プロテアーゼ、エステラーゼおよび DPP-IV 阻害剤のカクテル、抗凝固剤 3,6 mg エチレンジアミン四酢酸二カリウム (K2EDTA)、ベクトン、Dickinson and Co.、ニュージャージー州、米国）。

グルコース恒常性のパラメータを評価した：ヘキソキナーゼ反応（Ｋｏｎｅｌａｂグルコース分析器、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｙ．、フィンランド）を使用した血漿グルコースおよび固相競合化学発光酵素イムノアッセイ（Ｉｍｍｕｌｉｔｅ ２０００、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ａ．Ｇ．、ドイツ）を使用した血清インスリン。

GLP-1 および GIP 分析には、市販の ELISA キットを使用しました。

BCAAの血清レベルは、非接触導電率検出を備えたキャピラリー電気泳動（CE）の方法によって決定されました。これについては、すでに詳細に説明されています[18]。 手短に：組み込みの非接触導電率検出器を備えたHP3DCEシステム（Agilent Technologies、Waldbronn、Germany）を使用してCE測定を実施しました。 分離は、フューズドシリカキャピラリー（全長31.4 cm、検出器まで14.7 cm、内径25μm、外径363μm、Composite Metal Services、英国）で25°Cの制御温度で行われました。 キャピラリーの内面は、最初の使用前に電気浸透流を防ぐために INST コーティング溶液 (Biotaq、米国) を使用してカバーされます [19]。 CE 分離は、20% v/v メタノール、pH 2.0 中の組成 3.2 mol/l 酢酸の最適化されたバックグラウンド電解質で実行されます。 達成された分離時間は、0.96 kV/cm の電界強度と 50 mbar の流体力学的圧力の同時適用で 125 秒でした。 血清中の分離効率は、バリンとイソロイシンで 461,000 プレート/m、ロイシンで 455,000 プレート/m でした。検出限界は、3 つのアミノ酸すべてで 0.4 μM です。 移動時間の再現性の相対的な標準偏差値は、1 日の測定では 0.1%、別の日の測定では 0.3% でした。ピーク面積の再現性の相対標準偏差値は、1 日の測定では 2.3 ～ 2.6%、別の日の測定では 2.7 ～ 4.6% でした。 血液サンプルは、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む試験管に採取されました。 得られた血清サンプルは、分析まで-20°Cの冷凍庫に保存されました。 分析の前に、250 μl の血清を 750 μL のアセトニトリルと混合することにより、凍結していない血清サンプルを除タンパクしました。 30 秒間振とうした後、エッペンドルフチューブで除タンパクを行いました。 次に、血清サンプルを 4 g の加速度で 45 秒間遠心分離しました。得られた上清 800 μL を CE 分析用に採取しました。

統計分析：データは、平均±平均の標準誤差（SEM）としてテキスト、表、および図に示され、p <0.05の値は統計的に有意であると見なされました。 インスリン、GIP、GLP-1、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの分泌応答は、曲線下の増分面積 (iAUC) として各被験者について計算されました。 iAUC の計算では、異なる個々のベースライン値が考慮されます。 iAUC は、台形モデルを使用して、グルコース、インスリン、および BCAA については 0 ～ 240 分、GLP-1 および GIP については 0 ～ 120 分で計算されました。 ベースラインを下回る個々の値はすべて除外され、それぞれの研究の各被験者は独自の参照でした。 グルコースの分泌応答は、応答が主に負であるため、減少 AUC (dAUC) として計算されました。 この場合、ベースラインを超える個々の値はすべて除外されました。 iAUC および個々の値の統計的比較のためのデータは、正規性についてテストされ、正規分布データについては、グループ間の差の統計的有意性をテストするために、Bonferroni の多重比較による一般線形モデル ANOVA を使用してサンプルを比較しました。 反復測定ANOVAテストを使用して、それぞれの治療ごとの時間効果を評価しました。 混合モデルANOVAを使用して、治療および時間対治療効果を評価しました。 グループ間の違いは、ボンフェローニの多重比較検定を使用して識別されました。 GraphPad Prism、リリース 5.03 (GraphPad ソフトウェア、サンディエゴ) を使用して、すべての統計手順を実行しました。