支链氨基酸的肠促胰岛素作用

研究方案：三个测试在不同的场合进行（至少间隔 7 天）。 第一个测试（IV BCAA 测试）包括 BCAA 溶液（Nutramin VLI 3%，Fresenius Kabi，KGaA，德国；亮氨酸 43%，异亮氨酸 24%，缬氨酸 33%）的 IV 应用，总剂量为 0.4 g/kg 2小时输注（平均溶液体积1023±34.6mL， BCAA 的平均总剂量 30.7±1.1g) 以遵守最大推荐输注速率。 第二项测试（口服 BCAA 测试）包括一次性口服 BCAA 胶囊（BCAA 胶囊，Reflex Nutrition，英国，布莱顿；亮氨酸 50%、异亮氨酸 25%、缬氨酸 25%），单剂量为 0.4g/kg（平均值BCAA 总剂量 30.7±1.1 g) 给药超过 30 秒，用 500 毫升自来水冲洗。 第三项测试（口服安慰剂测试）包括一次口服安慰剂胶囊（甲基纤维素，大学医院机构药房制备），单次剂量为 0.4 g/kg，持续 30 秒，用 500 mL 自来水冲洗。 安慰剂胶囊的内容物与 BCAA 胶囊一样称重和包装。 无论是参与者还是管理胶囊和执行方案的工作人员都不知道胶囊的内容，因此可以维持随机双盲设置。

血液分析：在禁食 12 小时（-15 分钟）后从每个受试者抽取基础外周静脉血，然后在整个过程中的时间 0、15、30、45、60、90、120、150、180、210、240 分钟抽取基础外周静脉血干涉。 立即分离血浆并将所有样品冷冻在-80°C直至进行分析。 对于 GLP-1 和 GIP 分析，BD P800 采血系统与开发用于保存血液中代谢肽的涂层（蛋白酶混合物、酯酶和 DPP-IV 抑制剂、抗凝剂 3.6 mg 乙二胺四乙酸二钾 (K2EDTA)、Becton , Dickinson and Co.，美国新泽西州）。

评估葡萄糖稳态参数：使用己糖激酶反应（Konelab 葡萄糖分析仪，Thermo Fisher Scientific，Oy，芬兰）的血浆葡萄糖和使用固相竞争化学发光酶免疫测定（Immulite 2000，Siemens A.G.，德国）的血清胰岛素。

市售的 ELISA 试剂盒用于 GLP-1 和 GIP 分析：用于 GLP-1 免疫生物实验室（免疫生物实验室，群马县，日本）和 GIP Millipore（EMD Millipore Corporation，Bilerica，MA，USA）。

BCAAs 的血清水平通过毛细管电泳 (CE) 方法和非接触式电导率检测来确定，这已经被详细描述 [18]。 简而言之：CE 测量是使用配备内置非接触式电导检测器的 HP3DCE 系统（安捷伦科技，Waldbronn，德国）进行的。 在 25 °C 的受控温度下，在熔融石英毛细管（总长 31.4 cm，到检测器 14.7 cm，内径 25 μm，外径 363 μm，Composite Metal Services，UK）中进行分离。 毛细管的内表面使用 INST 涂层溶液（Biotaq，美国）覆盖，以防止首次使用前发生电渗流 [19]。 CE 分离在优化的背景电解质中进行，其组成为 3.2 mol/l 乙酸，溶于 20% v/v 甲醇，pH 2.0。 在 0.96 kV/cm 的电场强度和同时施加 50 mbar 的流体动力压力下，实现的分离时间为 125 秒。 血清中缬氨酸和异亮氨酸的分离效率为 461,000 板/m，亮氨酸为 455,000 板/m；所有三种氨基酸的检测限都等于 0.4 µM。 迁移时间重复性的相对标准偏差值对于单日测量为 0.1%，对于不同日测量为 0.3%；峰面积重复性的相对标准偏差值等于 2.3 - 2.6%（单日测量）和 2.7 - 4.6%（不同日测量）。 血液样本收集在含有乙二胺四乙酸 (EDTA) 的试管中。 将获得的血清样品储存在-20°C的冰箱中直至分析。 在分析之前，将 250 µl 血清与 750 µL 乙腈混合，对未冷冻的血清样品进行脱蛋白处理。 震荡 30s 后在 Eppendorf 管中进行脱蛋白。 然后将血清样本以4 g的加速度离心45 s；取 800 µL 获得的上清液用于 CE 分析。

统计分析：数据以文本、表格和图形的形式呈现为平均值±平均值的标准误差（SEM），p<0.05 的值被认为具有统计学意义。 计算每个受试者的胰岛素、GIP、GLP-1、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的分泌反应作为曲线下增量面积 (iAUC)。 iAUCs 计算允许不同的个体基线值。 使用梯形模型计算 iAUC，葡萄糖、胰岛素和 BCAA 为 0-240 分钟，GLP-1 和 GIP 为 0-120。 所有低于基线的个体值都被排除在外，各自研究中的每个受试者都是他们自己的参考。 葡萄糖的分泌反应被计算为递减 AUC (dAUC)，因为反应主要是阴性的。 案例中排除了高于基线的所有单个值。 用于 iAUC 和个体值的统计比较数据的正态性和正态分布数据进行测试，使用一般线性模型 ANOVA 与 Bonferroni 的多重比较来比较样本以测试组间差异的统计显着性。 重复测量 ANOVA 测试用于评估每个相应治疗的时间效应。 混合模型方差分析用于评估治疗和时间对治疗效果。 使用 Bonferroni 的多重比较检验确定组间差异。 GraphPad Prism，5.03 版（GraphPad 软件，圣地亚哥）用于执行所有统计程序。