Inkretineffekter av förgrenade aminosyror

Studieprotokoll: Tre tester utfördes vid ett annat tillfälle (minst 7 dagar emellan). Första testet (IV BCAA-test) bestod av IV-applicering av BCAA-lösning (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Tyskland; Leucin 43%, Isoleucin 24%, Valin 33%) i total dos på 0,4 g/kg i en 2 timmars infusion (medellösningsvolym 1023±34,6 ml, genomsnittlig totaldos av BCAA 30,7±1,1g) för att respektera maximal rekommenderad infusionshastighet. Andra testet (ORAL BCAA-test) bestod av omedelbart oralt intag av BCAA-kapslar (BCAA-kapslar, Reflex Nutrition, Storbritannien, Brighton; Leucin 50 %, Isoleucin 25 %, Valine 25 %) i en enkeldos på 0,4 g/kg (medelvärde) total dos av BCAA 30,7±1,1 g) administrerad över 30 sekunder, sköljd med 500 ml kranvatten. Tredje testet (ORAL PLACEBO-test) bestod av omedelbart oralt intag av placebokapslar (metylcellulosa, beredd universitetssjukhusinstitution) i en engångsdos på 0,4 g/kg administrerad under 30 s, sköljd med 500 ml kranvatten. Innehållet i placebokapslar vägdes och packades identiskt med BCAA-kapslar. Varken deltagare eller personal som administrerade kapslar och utförde protokollet kände inte till kapslarnas innehåll så att randomiserade dubbelblinda inställningar kunde ha bibehållits.

Blodanalys: Basalt perifert venöst blod togs från varje individ efter 12 timmars fasta (-15 min) och sedan vid tidpunkten 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 minuter under hela intervention. Plasma separerades omedelbart och alla prover frystes vid -80 °C tills analys utfördes. För GLP-1 och GIP-analys användes BD P800 Blood Collection System med päls utvecklad för att bevara metaboliska peptider i blodet (cocktail av proteaser, esteras och DPP-IV-hämmare, antikoagulant 3,6 mg di-kaliumetylendiamintetraättiksyra (K2EDTA), Becton , Dickinson och Co., New Jersey, USA).

Parametrar för glukoshomeostas utvärderades: plasmaglukos med användning av hexokinasreaktion (Konelab Glucose analyzer, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finland) och seruminsulin med användning av fastfas-kompetitiv kemiluminescerande enzymimmunanalys (Immulite 2000, Siemens A.G., Tyskland).

Kommersiellt tillgängliga ELISA-kit användes för GLP-1- och GIP-analys: för GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan) och för GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

Serumnivåer av BCAA bestämdes med en metod för kapillärelektrofores (CE) med kontaktlös konduktivitetsdetektion, vilket redan har beskrivits i detaljer [18]. Inom kort: CE-mätningar utfördes med hjälp av HP3DCE-systemet (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland) utrustad med en inbyggd kontaktlös konduktivitetsdetektor. Separation ägde rum i en kapillär av smält kiseldioxid (31,4 cm i total längd, 14,7 cm till detektor, 25 μm innerdiameter, 363 μm ytterdiameter, Composite Metal Services, Storbritannien) vid den kontrollerade temperaturen på 25 °C. Den inre ytan av kapillären täcks med INST-beläggningslösning (Biotaq, U.S.A.) för att förhindra elektroosmotiskt flöde innan den används första gången [19]. CE-separationen utförs i en optimerad bakgrundselektrolyt med sammansättningen 3,2 mol/l ättiksyra i 20% v/v metanol, pH 2,0. Den uppnådda separationstiden var 125 s vid en elektrisk fältintensitet på 0,96 kV/cm och samtidigt applicering av ett hydrodynamiskt tryck på 50 mbar. Separationseffektiviteten i blodserum var lika med 461 000 plattor/m för valin och isoleucin och 455 000 plattor/m för leucin; detektionsgränserna är lika med 0,4 µM för alla tre aminosyrorna. De relativa standardavvikelsevärdena för repeterbarhet av migreringstiden var lika med 0,1 % för mätningar under en enskild dag och 0,3 % för mätningar på olika dagar; de relativa standardavvikelsevärdena för repeterbarhet av toppareorna motsvarade 2,3 - 2,6 % för mätningar under en enskild dag och 2,7 - 4,6 % för mätningar på olika dagar. Blodprover togs i provrör innehållande etylendiamintetraättiksyra (EDTA). De erhållna serumproverna förvarades i en frys vid -20°C fram till analysen. Före analysen avproteiniserades de ofrysta serumproverna genom att blanda 250 µl serum med 750 µL acetonitril. Avproteinisering utfördes i ett Eppendorf-rör efter skakning i 30 sekunder. Därefter centrifugerades serumproverna med en acceleration av 4 g under 45 s; 800 µL av den erhållna supernatanten togs för CE-analys.

Statistisk analys: Data presenteras i text, tabeller och figurer som medelvärden ± standardfel av medelvärdet (SEM) och värden på p<0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta. Sekretionssvar för insulin, GIP, GLP-1, valin, leucin och isoleucin beräknades för varje individ som inkrementella områden under kurvan (iAUC). iAUCs beräkning tillåter olika individuella baslinjevärden. iAUCs beräknades med hjälp av trapetsmodellen, från 0-240 minuter för glukos, insulin och BCAA och 0-120 för GLP-1 och GIP. Alla individuella värden under baslinjen exkluderades och varje individ i respektive studie var sin egen referens. Sekretionssvar för glukos beräknades som dekrementell AUC (dAUC) eftersom svaret är övervägande negativt. Alla individuella värden över baslinjen exkluderades i fallet. Data för statistisk jämförelse för iAUC och individuella värden testades för normalitet och för normalfördelade data jämfördes prover med hjälp av generell linjär modell ANOVA med Bonferronis multipeljämförelse för att testa den statistiska signifikansen av skillnader mellan grupper. Upprepade åtgärder ANOVA-test användes för att bedöma tidseffekt för varje respektive behandling. Blandad modell ANOVA användes för att bedöma behandling och tid kontra behandlingseffekt. Skillnader mellan grupper identifierades med hjälp av Bonferronis multipla jämförelsetester. GraphPad Prism, version 5.03 (GraphPad programvara, San Diego) användes för att utföra alla statistiska procedurer.