Efectos de la incretina de los aminoácidos de cadena ramificada

Protocolos de estudio: Se realizaron tres pruebas en una ocasión diferente (al menos 7 días entre ellas). Primera prueba (prueba IV BCAA) compuesta por la aplicación IV de solución BCAA (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Alemania; Leucina 43%, Isoleucina 24%, Valina 33%) en dosis total de 0,4 g/kg en una infusión de 2 h (volumen medio de solución 1023±34,6 ml, dosis total media de BCAA 30,7 ± 1,1 g) para respetar la tasa de infusión máxima recomendada. Segunda prueba (prueba ORAL BCAA) compuesta por la ingestión oral inmediata de cápsulas de BCAA (cápsulas de BCAA, Reflex Nutrition, Reino Unido, Brighton; Leucina 50 %, Isoleucina 25 %, Valina 25 %) en una dosis única de 0,4 g/kg (media dosis total de BCAA 30,7±1,1 g) administrada durante 30 s, regada con 500 ml de agua del grifo. Tercera prueba (Prueba PLACEBO ORAL) compuesta por la ingestión oral inmediata de cápsulas de placebo (metilcelulosa, preparado por la farmacia de la institución hospitalaria Universitaria) en dosis única de 0,4 g/kg administrada en 30 s, regada con 500 mL de agua del grifo. El contenido de las cápsulas de placebo se pesó y envasó de forma idéntica a las cápsulas de BCAA. Ni los participantes ni el personal que administró las cápsulas y llevó a cabo el protocolo desconocían el contenido de las cápsulas, por lo que se podrían haber mantenido entornos aleatorios doble ciego.

Análisis de sangre: Se extrajo sangre venosa periférica basal de cada sujeto después de 12 h de ayuno (-15 min) y luego a los 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min durante todo el intervención. El plasma se separó inmediatamente y todas las muestras se congelaron a -80 °C hasta que se realizó el análisis. Para el análisis de GLP-1 y GIP se utilizó el sistema de extracción de sangre BD P800 con una capa desarrollada para preservar los péptidos metabólicos en la sangre (cóctel de proteasas, esterasa e inhibidores de la DPP-IV, anticoagulante 3,6 mg de ácido dipotásico etilendiaminotetraacético (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., Nueva Jersey, EE. UU.).

Se evaluaron los parámetros de la homeostasis de la glucosa: glucosa plasmática mediante la reacción de hexoquinasa (analizador de glucosa Konelab, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finlandia) e insulina sérica mediante inmunoensayo enzimático quimioluminiscente competitivo en fase sólida (Immulite 2000, Siemens A.G., Alemania).

Se utilizaron kits ELISA disponibles comercialmente para el análisis de GLP-1 y GIP: para GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japón) y para GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, EE. UU.).

Los niveles séricos de BCAA se determinaron mediante el método de electroforesis capilar (CE) con detección de conductividad sin contacto, que ya se ha descrito en detalle [18]. En breve: las mediciones de CE se llevaron a cabo utilizando el sistema HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) equipado con un detector de conductividad sin contacto incorporado. La separación tuvo lugar en un capilar de sílice fundida (31,4 cm de longitud total, 14,7 cm hasta el detector, 25 μm de diámetro interior, 363 μm de diámetro exterior, Composite Metal Services, Reino Unido) a la temperatura controlada de 25 °C. La superficie interna del capilar se cubre con una solución de recubrimiento INST (Biotaq, EE. UU.) para evitar el flujo electroosmótico antes de su primer uso [19]. La separación CE se realiza en un electrolito de fondo optimizado con una composición de ácido acético de 3,2 mol/l en metanol al 20 % v/v, pH 2,0. El tiempo de separación logrado fue de 125 s a una intensidad de campo eléctrico de 0,96 kV/cm y aplicación simultánea de una presión hidrodinámica de 50 mbar. La eficiencia de separación en suero sanguíneo fue de 461 000 platos/m para valina e isoleucina y de 455 000 platos/m para leucina; los límites de detección son iguales a 0,4 µM para los tres aminoácidos. Los valores de desviación estándar relativa para la repetibilidad del tiempo de migración fueron del 0,1 % para las mediciones durante un solo día y del 0,3 % para las mediciones en días diferentes; los valores de desviación estándar relativa para la repetibilidad de las áreas de los picos fueron del 2,3 al 2,6 % para las mediciones durante un solo día y del 2,7 al 4,6 % para las mediciones en días diferentes. Las muestras de sangre se recogieron en tubos de ensayo que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Las muestras de suero obtenidas se almacenaron en un congelador a -20 °C hasta el momento del análisis. Antes del análisis, las muestras de suero descongeladas se desproteinizaron mezclando 250 µl de suero con 750 µL de acetonitrilo. La desproteinización se realizó en un tubo Eppendorf después de agitar durante 30 s. Luego, las muestras de suero se centrifugaron a una aceleración de 4 g durante 45 s; Se tomaron 800 µL del sobrenadante obtenido para análisis de CE.

Análisis estadístico: Los datos se presentan en texto, tablas y figuras como medias ± error estándar de la media (SEM) y los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Las respuestas de secreción de insulina, GIP, GLP-1, valina, leucina e isoleucina se calcularon para cada sujeto como áreas incrementales bajo la curva (iAUC). El cálculo de iAUC permite diferentes valores de referencia individuales. Las iAUC se calcularon utilizando el modelo trapezoidal, de 0 a 240 min para glucosa, insulina y BCAA y de 0 a 120 para GLP-1 y GIP. Se excluyeron todos los valores individuales por debajo de la línea de base y cada sujeto en el estudio respectivo fue su propia referencia. Las respuestas de secreción de glucosa se calcularon como AUC decreciente (dAUC) ya que la respuesta es predominantemente negativa. Todos los valores individuales por encima de la línea de base fueron excluidos en el caso. Los datos para la comparación estadística de iAUC y los valores individuales se probaron para la normalidad y para los datos normalmente distribuidos, las muestras se compararon usando el modelo lineal general ANOVA con la comparación múltiple de Bonferroni para probar la significación estadística de las diferencias entre los grupos. Se usó la prueba ANOVA de medidas repetidas para evaluar el efecto del tiempo para cada tratamiento respectivo. Se utilizó ANOVA de modelo mixto para evaluar el tratamiento y el tiempo frente al efecto del tratamiento. Las diferencias entre los grupos se identificaron mediante las pruebas de comparaciones múltiples de Bonferroni. Se usó GraphPad Prism, versión 5.03 (software GraphPad, San Diego) para realizar todos los procedimientos estadísticos.