Effetti incretinici degli aminoacidi a catena ramificata

Protocolli di studio: tre test sono stati condotti in un'occasione diversa (almeno 7 giorni in mezzo). Primo test (IV test BCAA) costituito dall'applicazione EV di soluzione BCAA (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Germania; Leucina 43%, Isoleucina 24%, Valina 33%) in dose totale di 0,4 g/kg in un'infusione di 2 h (volume medio della soluzione 1023±34,6 ml, dose totale media di BCAA 30,7±1,1 g) per rispettare la massima velocità di infusione raccomandata. Secondo test (ORAL BCAA test) costituito dall'ingestione orale immediata di capsule BCAA (BCAA capsules, Reflex Nutrition, UK, Brighton; Leucina 50%, Isoleucina 25%, Valina 25%) in una singola dose di 0,4 g/kg (media dose totale di BCAA 30,7±1,1 g) somministrata in 30 secondi, lavata con 500 ml di acqua di rubinetto. Terzo test (ORAL PLACEBO test) costituito dall'ingestione orale immediata di capsule di placebo (metilcellulosa, preparato in farmacia dell'istituto ospedaliero universitario) in un'unica dose di 0,4 g/kg somministrata in 30 s, lavata con 500 mL di acqua di rubinetto. Il contenuto delle capsule placebo è stato pesato e confezionato in modo identico a quello delle capsule BCAA. Né i partecipanti né il personale che somministrava le capsule e che eseguiva il protocollo non erano a conoscenza del contenuto delle capsule in modo che le impostazioni randomizzate in doppio cieco potessero essere mantenute.

Analisi del sangue: il sangue venoso periferico basale è stato prelevato da ciascun soggetto dopo 12 ore di digiuno (-15 min) e poi ai tempi 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min per tutto il intervento. Il plasma è stato immediatamente separato e tutti i campioni sono stati congelati a -80 °C fino all'esecuzione dell'analisi. Per l'analisi GLP-1 e GIP è stato utilizzato il BD P800 Blood Collection System con rivestimento sviluppato per preservare i peptidi metabolici nel sangue (cocktail di proteasi, esterasi e inibitori della DPP-IV, anticoagulante 3,6 mg di-potassio acido etilendiamminotetraacetico (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., New Jersey, USA).

Sono stati valutati i parametri dell'omeostasi del glucosio: glucosio plasmatico mediante reazione di esochinasi (analizzatore di glucosio Konelab, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finlandia) e insulina sierica mediante dosaggio immunoenzimatico competitivo in fase solida chemiluminescente (Immulite 2000, Siemens A.G., Germania).

I kit ELISA disponibili in commercio sono stati utilizzati per l'analisi GLP-1 e GIP: per GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Giappone) e per GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

I livelli sierici di BCAA sono stati determinati mediante il metodo dell'elettroforesi capillare (CE) con rilevamento della conduttività senza contatto, che è già stato descritto in dettaglio [18]. In breve: le misurazioni CE sono state effettuate utilizzando il sistema HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania) dotato di un rilevatore di conducibilità senza contatto integrato. La separazione è avvenuta in un capillare di silice fusa (31,4 cm di lunghezza totale, 14,7 cm al rivelatore, 25 μm di diametro interno, 363 μm di diametro esterno, Composite Metal Services, Regno Unito) alla temperatura controllata di 25 °C. La superficie interna del capillare è coperta utilizzando la soluzione di rivestimento INST (Biotaq, U.S.A.) per prevenire il flusso elettroosmotico prima del suo primo utilizzo [19]. La separazione CE viene eseguita in un elettrolita di fondo ottimizzato con composizione 3,2 mol/l di acido acetico in metanolo al 20% v/v, pH 2,0. Il tempo di separazione raggiunto è stato di 125 s con un'intensità di campo elettrico di 0,96 kV/cm e l'applicazione simultanea di una pressione idrodinamica di 50 mbar. L'efficienza di separazione nel siero del sangue è pari a 461.000 piastre/m per valina e isoleucina e 455.000 piastre/m per leucina; i limiti di rilevabilità sono pari a 0,4 µM per tutti e tre gli amminoacidi. I valori di deviazione standard relativa per la ripetibilità del tempo di migrazione sono stati pari allo 0,1% per le misurazioni durante un singolo giorno e allo 0,3% per le misurazioni in giorni diversi; i valori di deviazione standard relativa per la ripetibilità delle aree dei picchi sono stati pari a 2,3 - 2,6% per le misurazioni durante un singolo giorno e 2,7 - 4,6% per le misurazioni in giorni diversi. I campioni di sangue sono stati raccolti in provette contenenti acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). I campioni di siero ottenuti sono stati conservati in un congelatore a -20 °C fino all'analisi. Prima dell'analisi, i campioni di siero non congelati sono stati deproteinizzati miscelando 250 µl di siero con 750 µL di acetonitrile. La deproteinizzazione è stata eseguita in una provetta Eppendorf dopo aver agitato per 30 secondi. Quindi i campioni di siero sono stati centrifugati ad un'accelerazione di 4 g per 45 s; 800 µL del surnatante ottenuto sono stati prelevati per l'analisi CE.

Analisi statistica: i dati sono presentati in testo, tabelle e figure come medie ± errore standard della media (SEM) e i valori di p<0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Le risposte di secrezione per insulina, GIP, GLP-1, valina, leucina e isoleucina sono state calcolate per ciascun soggetto come aree incrementali sotto la curva (iAUC). Il calcolo degli iAUC consente diversi valori di riferimento individuali. Le iAUC sono state calcolate utilizzando il modello trapezoidale, da 0 a 240 min per glucosio, insulina e BCAA e da 0 a 120 per GLP-1 e GIP. Tutti i valori individuali al di sotto del basale sono stati esclusi e ciascun soggetto nel rispettivo studio era il proprio riferimento. Le risposte di secrezione per il glucosio sono state calcolate come AUC decrementale (dAUC) poiché la risposta è prevalentemente negativa. Tutti i valori individuali al di sopra della linea di base sono stati esclusi nel caso. I dati per il confronto statistico per iAUC e i valori individuali sono stati testati per la normalità e per i dati normalmente distribuiti, i campioni sono stati confrontati utilizzando il modello lineare generale ANOVA con il confronto multiplo di Bonferroni per testare la significatività statistica delle differenze tra i gruppi. Il test ANOVA a misure ripetute è stato utilizzato per valutare l'effetto del tempo per ogni rispettivo trattamento. Il modello misto ANOVA è stato utilizzato per valutare il trattamento e il tempo rispetto all'effetto del trattamento. Le differenze tra i gruppi sono state identificate utilizzando i test di confronto multiplo di Bonferroni. GraphPad Prism, versione 5.03 (software GraphPad, San Diego) è stato utilizzato per eseguire tutte le procedure statistiche.