Inkretinové účinky aminokyselin s rozvětveným řetězcem

Protokoly studie: Byly provedeny tři testy při různých příležitostech (alespoň 7 dní mezi nimi). První test (IV BCAA test) sestával z IV aplikace roztoku BCAA (Nutramin VLI 3 %, Fresenius Kabi, KGaA, Německo; Leucin 43 %, Isoleucin 24 %, Valin 33 %) v celkové dávce 0,4 g/kg v 2 h infuze (průměrný objem roztoku 1023±34,6 ml, průměrná celková dávka BCAA 30,7±1,1g), aby byla dodržena maximální doporučená rychlost infuze. Druhý test (ORÁLNÍ BCAA test) sestával z okamžitého perorálního požití kapslí BCAA (kapsle BCAA, Reflex Nutrition, UK, Brighton; Leucin 50 %, Isoleucin 25 %, Valin 25 %) v jedné dávce 0,4 g/kg (průměr celková dávka BCAA 30,7 ± 1,1 g) podaná během 30 s, smyta 500 ml vody z vodovodu. Třetí test (ORÁLNÍ PLACEBO test) sestával z okamžitého perorálního požití kapslí s placebem (methylcelulóza, připravena v lékárně fakultní nemocnice) v jedné dávce 0,4 g/kg podané během 30 s, opláchnuté 500 ml vody z vodovodu. Obsah kapslí s placebem byl zvážen a zabalen stejně jako kapsle BCAA. Ani účastníci, ani zaměstnanci, kteří tobolky podávali a prováděli protokol, nevěděli o obsahu tobolek, takže mohla být zachována randomizovaná dvojitě zaslepená nastavení.

Analýza krve: Bazální periferní žilní krev byla každému subjektu odebrána po 12 hodinách hladovění (-15 minut) a poté v čase 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 minut po celou dobu zásah. Plazma byla okamžitě oddělena a všechny vzorky byly zmraženy při -80 °C, dokud nebyla provedena analýza. Pro analýzu GLP-1 a GIP byl použit systém odběru krve BD P800 s povlakem vyvinutým pro uchování metabolických peptidů v krvi (koktejl proteáz, esterázy a inhibitory DPP-IV, antikoagulant 3,6 mg didraselná kyselina ethylendiamintetraoctová (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., New Jersey, USA).

Parametry glukózové homeostázy byly hodnoceny: plazmatická glukóza pomocí hexokinázové reakce (Konelab Glucose analyzátor, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finsko) a sérový inzulín pomocí kompetitivní chemiluminiscenční enzymové imunoanalýzy na pevné fázi (Immulite 2000, Siemens AG, Německo).

Pro analýzu GLP-1 a GIP byly použity komerčně dostupné soupravy ELISA: pro GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japonsko) a pro GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

Sérové ​​hladiny BCAA byly stanoveny metodou kapilární elektroforézy (CE) s bezkontaktní vodivostní detekcí, která již byla podrobně popsána [18]. Krátce: CE měření byla provedena pomocí systému HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo) vybaveného vestavěným bezkontaktním detektorem vodivosti. Separace probíhala v kapiláře z křemenného skla (celková délka 31,4 cm, 14,7 cm k detektoru, vnitřní průměr 25 μm, vnější průměr 363 μm, Composite Metal Services, Velká Británie) při kontrolované teplotě 25 °C. Vnitřní povrch kapiláry je pokryt nátěrovým roztokem INST (Biotaq, U.S.A.), aby se zabránilo elektroosmotickému toku před jejím prvním použitím [19]. CE separace se provádí v optimalizovaném pozadí elektrolytu se složením 3,2 mol/l kyseliny octové v 20% v/v methanolu, pH 2,0. Dosažená doba separace byla 125 s při intenzitě elektrického pole 0,96 kV/cm a současné aplikaci hydrodynamického tlaku 50 mbar. Účinnost separace v krevním séru se rovnala 461 000 destičkám/m pro valin a isoleucin a 455 000 destiček/m pro leucin; detekční limity se rovnají 0,4 µM pro všechny tři aminokyseliny. Hodnoty relativní směrodatné odchylky pro opakovatelnost migračního času se rovnaly 0,1 % pro měření během jednoho dne a 0,3 % pro měření v různých dnech; hodnoty relativní směrodatné odchylky pro opakovatelnost oblastí píku se rovnaly 2,3 - 2,6 % pro měření během jednoho dne a 2,7 - 4,6 % pro měření v různých dnech. Vzorky krve byly odebírány do zkumavek obsahujících kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA). Získané vzorky séra byly až do analýzy skladovány v mrazáku při -20 °C. Před analýzou byly vzorky nezmraženého séra deproteinovány smícháním 250 ul séra se 750 ul acetonitrilu. Deproteinizace byla provedena v Eppendorfově zkumavce po 30s protřepávání. Poté byly vzorky séra centrifugovány při zrychlení 4 g po dobu 45 s; 800 ul získaného supernatantu bylo odebráno pro CE analýzu.

Statistická analýza: Data jsou uvedena v textu, tabulkách a obrázcích jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM) a hodnoty p<0,05 byly považovány za statisticky významné. Sekreční reakce pro inzulín, GIP, GLP-1, valin, leucin a isoleucin byly vypočteny pro každý subjekt jako přírůstkové plochy pod křivkou (iAUC). Výpočet iAUC umožňuje různé individuální základní hodnoty. iAUC byly vypočteny pomocí lichoběžníkového modelu, od 0-240 min pro glukózu, inzulín a BCAA a 0-120 pro GLP-1 a GIP. Všechny jednotlivé hodnoty pod výchozí linií byly vyloučeny a každý subjekt v příslušné studii byl svým vlastním referencí. Sekreční odpovědi na glukózu byly vypočteny jako dekrementální AUC (dAUC), protože odpověď je převážně negativní. Všechny jednotlivé hodnoty nad výchozí hodnotou byly v případě vyloučeny. Data pro statistické srovnání pro iAUC a jednotlivé hodnoty byla testována na normalitu a pro data s normálním rozložením byly vzorky porovnány pomocí obecného lineárního modelu ANOVA s Bonferroniho vícenásobným srovnáním pro testování statistické významnosti rozdílů mezi skupinami. Opakovaná měření ANOVA test byl použit k posouzení časového efektu pro každou příslušnou léčbu. Smíšený model ANOVA byl použit pro hodnocení léčby a času vs. účinek léčby. Rozdíly mezi skupinami byly identifikovány pomocí Bonferroniho vícenásobných srovnávacích testů. K provedení všech statistických postupů byl použit GraphPad Prism, verze 5.03 (software GraphPad, San Diego).