Az elágazó láncú aminosavak inkretin hatásai

Vizsgálati protokollok: Három tesztet végeztek el egy másik alkalommal (legalább 7 nap között). Az első teszt (IV. BCAA-teszt) BCAA-oldat (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Németország; Leucin 43%, Isoleucin 24%, Valine 33%) IV alkalmazásából állt, összesen 0,4 g/kg dózisban. 2 órás infúzió (átlagos oldat térfogata 1023±34,6 ml, a BCAA átlagos összdózisa 30,7±1,1 g) a maximális ajánlott infúziós sebesség betartása érdekében. A második teszt (ORAL BCAA teszt) BCAA kapszulák (BCAA kapszula, Reflex Nutrition, Egyesült Királyság, Brighton; Leucin 50%, Isoleucin 25%, Valine 25%) egyszeri, 0,4 g/kg (átlagos) adagban történő szájon át történő bevételéből áll. BCAA teljes dózisa 30,7±1,1 g) 30 másodperc alatt beadva, 500 ml csapvízzel lemosva. A harmadik teszt (ORAL PLACEBO teszt) a placebo kapszulák (metilcellulóz, Egyetemi Kórházi Gyógyszertárban elkészített) egyszeri, 0,4 g/ttkg dózisban történő, 30 másodperc alatt történő beadásából, 500 ml csapvízzel lemosásból áll. A placebo kapszulák tartalmát a BCAA kapszulákkal azonosan súlyoztuk és csomagoltuk. Sem a résztvevők, sem a kapszulákat beadó és a protokollt végrehajtó személyzet nem tudtak a kapszulák tartalmáról, így a véletlenszerű kettős vak beállításokat fenn lehetett tartani.

Vérelemzés: Minden alanytól perifériás alapvért vettünk 12 órás éheztetés után (-15 perc), majd 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 perccel a teljes időtartam alatt. közbelépés. A plazmát azonnal elválasztottuk, és az összes mintát -80 °C-on lefagyasztottuk az elemzés elvégzéséig. A GLP-1 és GIP analízishez a BD P800 Blood Collection System-t használtuk a metabolikus peptidek vérben való megőrzésére kifejlesztett bevonattal (proteázok, észteráz és DPP-IV inhibitorok koktélja, véralvadásgátló 3,6 mg di-kálium-etilén-diamin-tetraecetsav (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., New Jersey, USA).

A glükóz homeosztázis paramétereit értékelték: plazma glükózt hexokináz reakcióval (Konelab Glucose analizátor, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finnország) és szérum inzulint szilárd fázisú kompetitív kemilumineszcens enzim immunoassay segítségével (Immulite 2000, Siemens A.G., Németország).

Kereskedelmi forgalomban kapható ELISA kiteket használtunk a GLP-1 és GIP analízishez: a GLP-1 Immuno-Biological Laboratories-hoz (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japán) és a GIP Millipore-hoz (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

A BCAA-k szérumszintjét kapilláris elektroforézis (CE) módszerrel határoztuk meg érintés nélküli vezetőképesség-detektálással, amelyet már részletesen leírtunk [18]. Röviden: A CE méréseket HP3DCE rendszerrel (Agilent Technologies, Waldbronn, Németország) végeztük, amely beépített érintésmentes vezetőképesség detektorral volt felszerelve. Az elválasztás olvasztott szilícium-dioxid kapillárisban történt (teljes hossza 31,4 cm, detektorig 14,7 cm, belső átmérője 25 μm, külső átmérője 363 μm, Composite Metal Services, Egyesült Királyság) 25 °C-os szabályozott hőmérsékleten. A kapilláris belső felületét INST bevonóoldattal (Biotaq, U.S.A.) borítják, hogy megakadályozzák az elektroozmotikus áramlást az első használat előtt [19]. A CE elválasztást optimalizált háttérelektrolitban végezzük, összetétele 3,2 mol/l ecetsav 20 térfogat% metanolban, pH 2,0. Az elért elválasztási idő 125 s volt 0,96 kV/cm elektromos térerősség mellett 50 mbar hidrodinamikai nyomás egyidejű alkalmazása mellett. A vérszérum elválasztási hatékonysága valin és izoleucin esetében 461 000 tányér/m, leucin esetében 455 000 lemez/m2; a kimutatási határok 0,4 µM mindhárom aminosav esetében. A vándorlási idő megismételhetőségének relatív szórása 0,1% volt az egy nap alatt végzett mérések és 0,3% a különböző napokon végzett mérések esetén; a csúcsterületek megismételhetőségének relatív szórása egy nap alatt 2,3-2,6%, a különböző napokon végzett mérések esetén 2,7-4,6% volt. A vérmintákat etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) tartalmazó kémcsövekbe gyűjtöttük. A kapott szérummintákat az elemzésig -20 °C-on fagyasztóban tároltuk. Az analízis előtt a nem fagyasztott szérummintákat fehérjementesítettük 250 µl szérum és 750 µl acetonitril összekeverésével. A fehérjementesítést Eppendorf-csőben végeztük 30 másodpercig tartó rázatás után. Ezután a szérummintákat 4 g gyorsulással 45 másodpercig centrifugáltuk; A kapott felülúszóból 800 µl-t vettünk CE analízishez.

Statisztikai analízis: Az adatokat szövegben, táblázatokban és ábrákban az átlag ± standard hiba (SEM) formájában mutatjuk be, és a p<0,05 értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Az inzulin, a GIP, a GLP-1, a valin, a leucin és az izoleucin szekréciós válaszait minden egyes alanynál a görbe alatti növekményes területként (iAUC) számítottuk. Az iAUC-számítás különböző egyedi alapértékeket tesz lehetővé. Az iAUC-kat trapézmodell segítségével számítottuk ki, 0-240 perc között glükóz, inzulin és BCAA, valamint 0-120 között GLP-1 és GIP esetében. Az alapvonal alatti összes egyedi értéket kizártuk, és a megfelelő vizsgálatban minden alany a saját referenciaértéke volt. A glükózra adott szekréciós válaszokat dekrementális AUC-ként (dAUC) számítottuk, mivel a válasz túlnyomórészt negatív. Ebben az esetben az alapvonal feletti összes egyedi értéket kizártuk. Az iAUC és az egyéni értékek statisztikai összehasonlítására szolgáló adatokat a normalitás, a normális eloszlású adatok esetében teszteltük, a mintákat általános lineáris ANOVA modellel hasonlítottuk össze Bonferroni többszörös összehasonlításával, hogy teszteljük a csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját. Ismételt mérések ANOVA tesztet alkalmaztunk az időhatás értékelésére minden egyes kezelésnél. Vegyes modell ANOVA-t használtunk a kezelés és az idő kontra kezelés hatásának értékelésére. A csoportok közötti különbségeket Bonferroni többszörös összehasonlító tesztjei segítségével azonosították. A GraphPad Prism 5.03-as kiadása (GraphPad szoftver, San Diego) minden statisztikai eljárást végrehajtott.