Efekty inkretynowe aminokwasów rozgałęzionych

Protokoły badań: Trzy testy przeprowadzono przy różnych okazjach (w odstępie co najmniej 7 dni). Pierwszy test (IV BCAA test) polegał na dożylnym podaniu roztworu BCAA (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Niemcy; Leucyna 43%, Izoleucyna 24%, Walina 33%) w łącznej dawce 0,4 g/kg w 2-godzinny wlew (średnia objętość roztworu 1023±34,6 ml, średnia całkowita dawka BCAA 30,7 ± 1,1 g), aby zachować maksymalną zalecaną szybkość infuzji. Drugi test (ORAL BCAA test) polegał na jednorazowym doustnym przyjęciu kapsułek BCAA (BCAA kapsułki, Reflex Nutrition, UK, Brighton; Leucyna 50%, Izoleucyna 25%, Walina 25%) w pojedynczej dawce 0,4 g/kg (średnia całkowita dawka BCAA 30,7 ± 1,1 g) podawana przez 30 sekund, popijana 500 ml wody z kranu. Trzeci test (doustny test PLACEBO) polegał na doustnym przyjęciu kapsułek placebo (metyloceluloza, przygotowana w aptece szpitala uniwersyteckiego) w pojedynczej dawce 0,4 g/kg podawanej przez 30 s, popijając 500 ml wody z kranu. Zawartość kapsułek placebo została zważona i zapakowana identycznie jak kapsułki BCAA. Ani uczestnicy, ani personel podający kapsułki i przeprowadzający protokół nie wiedzieli o zawartości kapsułek, aby można było zachować randomizowane ustawienia z podwójnie ślepą próbą.

Analiza krwi: Podstawową krew żylną obwodową pobierano od każdego badanego po 12 godzinach postu (-15 min), a następnie w czasie 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min przez cały okres interwencja. Osocze natychmiast oddzielono i wszystkie próbki zamrożono w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analizy. Do analizy GLP-1 i GIP użyto systemu do pobierania krwi BD P800 z powłoką opracowaną w celu zachowania peptydów metabolicznych we krwi (koktajl proteaz, inhibitory esterazy i DPP-IV, antykoagulant 3,6 mg dipotasowy kwas etylenodiaminotetraoctowy (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., New Jersey, USA).

Oceniono parametry homeostazy glukozy: glukozę w osoczu za pomocą reakcji heksokinazy (Konelab Glucose analyser, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finlandia) oraz insulinę w surowicy za pomocą kompetycyjnego testu immunoenzymatycznego chemiluminescencji w fazie stałej (Immulite 2000, Siemens A.G., Niemcy).

Do analizy GLP-1 i GIP zastosowano dostępne w handlu zestawy ELISA: dla GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japonia) i dla GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

Stężenia BCAA w surowicy oznaczano metodą elektroforezy kapilarnej (CE) z bezkontaktową detekcją przewodnictwa, co zostało już szczegółowo opisane [18]. W skrócie: Pomiary CE przeprowadzono za pomocą systemu HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Niemcy) wyposażonego we wbudowany bezdotykowy detektor przewodnictwa. Separacja odbywała się w kapilarze ze stopionej krzemionki (długość całkowita 31,4 cm, odległość od detektora 14,7 cm, średnica wewnętrzna 25 μm, średnica zewnętrzna 363 μm, Composite Metal Services, Wielka Brytania) w kontrolowanej temperaturze 25°C. Wewnętrzna powierzchnia kapilary jest pokryta roztworem powlekającym INST (Biotaq, USA), aby zapobiec przepływowi elektroosmotycznemu przed jej pierwszym użyciem [19]. Separację CE przeprowadza się w zoptymalizowanym elektrolicie tła o składzie 3,2 mol/l kwasu octowego w 20% obj./obj. metanolu, pH 2,0. Uzyskany czas rozdzielania wyniósł 125 s przy natężeniu pola elektrycznego 0,96 kV/cm i jednoczesnym działaniu ciśnienia hydrodynamicznego 50 mbar. Wydajność separacji w surowicy krwi wynosiła 461 000 płytek/m dla waliny i izoleucyny oraz 455 000 płytek/m dla leucyny; granice wykrywalności są równe 0,4 µM dla wszystkich trzech aminokwasów. Względne wartości odchylenia standardowego powtarzalności czasu migracji wyniosły 0,1% dla pomiarów w ciągu jednej doby i 0,3% dla pomiarów w różnych dniach; wartości względnego odchylenia standardowego dla powtarzalności powierzchni pików wynosiły 2,3 - 2,6% dla pomiarów w ciągu jednej doby i 2,7 - 4,6% dla pomiarów w różnych dniach. Próbki krwi pobrano do probówek zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Otrzymane próbki surowicy przechowywano w zamrażarce w temperaturze -20°C do czasu analizy. Przed analizą niezamrożone próbki surowicy odbiałczono przez zmieszanie 250 µl surowicy z 750 µl acetonitrylu. Odbiałczenie prowadzono w probówce Eppendorfa po wytrząsaniu przez 30 sekund. Następnie próbki surowicy wirowano przy przyspieszeniu 4 g przez 45 s; 800 µl otrzymanego supernatantu pobrano do analizy CE.

Analiza statystyczna: Dane przedstawiono w tekście, tabelach i rycinach jako średnie ± błąd standardowy średniej (SEM), a wartości p<0,05 uznano za istotne statystycznie. Odpowiedzi wydzielania dla insuliny, GIP, GLP-1, waliny, leucyny i izoleucyny obliczono dla każdego osobnika jako przyrostowe pola pod krzywą (iAUC). Obliczenia iAUC pozwalają na różne indywidualne wartości wyjściowe. iAUC obliczono przy użyciu modelu trapezoidalnego, od 0-240 min dla glukozy, insuliny i BCAA oraz 0-120 dla GLP-1 i GIP. Wszystkie indywidualne wartości poniżej linii podstawowej zostały wykluczone, a każdy pacjent w odpowiednim badaniu stanowił własne odniesienie. Odpowiedzi wydzielania dla glukozy obliczono jako zmniejszające się AUC (dAUC), ponieważ odpowiedź jest przeważnie ujemna. Wszystkie indywidualne wartości powyżej linii bazowej zostały wykluczone w przypadku. Dane do porównania statystycznego dla iAUC i poszczególnych wartości zbadano pod kątem normalności, a dla danych o rozkładzie normalnym próbki porównano przy użyciu ogólnego modelu liniowego ANOVA z wielokrotnym porównaniem Bonferroniego w celu zbadania istotności statystycznej różnic między grupami. Test ANOVA z powtarzanymi pomiarami zastosowano do oceny efektu czasowego dla każdego odpowiedniego traktowania. Mieszany model ANOVA zastosowano do oceny leczenia i czasu w stosunku do efektu leczenia. Różnice między grupami zidentyfikowano za pomocą testów wielokrotnych porównań Bonferroniego. GraphPad Prism, wydanie 5.03 (oprogramowanie GraphPad, San Diego) użyto do wykonania wszystkich procedur statystycznych.