Effets sur les incrétines des acides aminés à chaîne ramifiée

Protocoles d'étude : Trois tests ont été effectués à une occasion différente (au moins 7 jours d'intervalle). Premier test (test IV BCAA) consistant en l'application IV d'une solution de BCAA (Nutramin VLI 3 %, Fresenius Kabi, KGaA, Allemagne ; Leucine 43 %, Isoleucine 24 %, Valine 33 %) à une dose totale de 0,4 g/kg dans une perfusion de 2 h (volume moyen de solution 1023 ± 34,6 ml, dose totale moyenne de BCAA 30,7 ± 1,1 g) pour respecter le débit de perfusion maximal recommandé. Deuxième test (test ORAL BCAA) consistant en une ingestion orale immédiate de gélules de BCAA (Gélules BCAA, Reflex Nutrition, UK, Brighton ; Leucine 50 %, Isoleucine 25 %, Valine 25 %) en une dose unique de 0,4 g/kg (valeur moyenne dose totale de BCAA 30,7 ± 1,1 g) administrée pendant 30 secondes, arrosée de 500 ml d'eau du robinet. Troisième test (test PLACEBO ORAL) consistant en l'ingestion orale en une seule fois de gélules placebo (méthylcellulose, préparation en pharmacie d'établissement hospitalo-universitaire) en une dose unique de 0,4 g/kg administrée en 30 s, arrosée de 500 mL d'eau du robinet. Le contenu des gélules placebo a été pesé et emballé de manière identique aux gélules de BCAA. Ni les participants ni le personnel administrant les capsules et exécutant le protocole ne connaissaient le contenu des capsules, de sorte que les paramètres randomisés en double aveugle auraient pu être maintenus.

Analyse sanguine : Du sang veineux périphérique basal a été prélevé sur chaque sujet après 12 h de jeûne (-15 min) puis aux temps 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min tout au long de la intervention. Le plasma a été immédiatement séparé et tous les échantillons ont été congelés à -80 °C jusqu'à ce que l'analyse soit effectuée. Pour l'analyse GLP-1 et GIP, le système de prélèvement sanguin BD P800 a été utilisé avec un revêtement développé pour préserver les peptides métaboliques dans le sang (cocktail de protéases, d'estérases et d'inhibiteurs de DPP-IV, anticoagulant 3,6 mg d'acide dipotassique éthylènediaminetétraacétique (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., New Jersey, États-Unis).

Les paramètres de l'homéostasie du glucose ont été évalués : glucose plasmatique à l'aide d'une réaction à l'hexokinase (analyseur de glucose Konelab, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finlande) et insuline sérique à l'aide d'un dosage immunoenzymatique chimiluminescent compétitif en phase solide (Immulite 2000, Siemens A.G., Allemagne).

Des kits ELISA disponibles dans le commerce ont été utilisés pour l'analyse GLP-1 et GIP : pour GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japon) et pour GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

Les taux sériques de BCAA ont été déterminés par la méthode d'électrophorèse capillaire (CE) avec détection de conductivité sans contact, qui a déjà été décrite en détail [18]. En peu de temps : des mesures CE ont été effectuées à l'aide du système HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne) équipé d'un détecteur de conductivité sans contact intégré. La séparation a eu lieu dans un capillaire en silice fondue (31,4 cm de longueur totale, 14,7 cm jusqu'au détecteur, 25 μm de diamètre intérieur, 363 μm de diamètre extérieur, Composite Metal Services, Royaume-Uni) à la température contrôlée de 25 °C. La surface interne du capillaire est recouverte d'une solution de revêtement INST (Biotaq, États-Unis) pour empêcher le flux électro-osmotique avant sa première utilisation [19]. La séparation CE est effectuée dans un électrolyte de fond optimisé de composition 3,2 mol/l d'acide acétique dans du méthanol à 20 % v/v, pH 2,0. Le temps de séparation obtenu était de 125 s à une intensité de champ électrique de 0,96 kV/cm et l'application simultanée d'une pression hydrodynamique de 50 mbar. L'efficacité de séparation dans le sérum sanguin était de 461 000 plaques/m pour la valine et l'isoleucine et de 455 000 plaques/m pour la leucine ; les limites de détection sont égales à 0,4 µM pour les trois acides aminés. Les valeurs d'écart type relatif pour la répétabilité du temps de migration étaient égales à 0,1 % pour les mesures au cours d'une seule journée et à 0,3 % pour les mesures à des jours différents ; les valeurs d'écart-type relatif pour la répétabilité des zones de pic s'élevaient à 2,3 - 2,6 % pour les mesures au cours d'une seule journée et à 2,7 - 4,6 % pour les mesures à des jours différents. Des échantillons de sang ont été prélevés dans des tubes à essai contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Les échantillons de sérum obtenus ont été stockés dans un congélateur à -20°C jusqu'à l'analyse. Avant l'analyse, les échantillons de sérum non congelés ont été déprotéinés en mélangeant 250 µl de sérum avec 750 µL d'acétonitrile. La déprotéinisation a été réalisée dans un tube Eppendorf après 30 secondes d'agitation. Puis les échantillons de sérum ont été centrifugés à une accélération de 4 g pendant 45 s ; 800 µL du surnageant obtenu ont été prélevés pour analyse CE.

Analyse statistique : Les données sont présentées dans le texte, les tableaux et les figures sous forme de moyennes ± erreur standard de la moyenne (SEM) et les valeurs de p<0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les réponses de sécrétion pour l'insuline, le GIP, le GLP-1, la valine, la leucine et l'isoleucine ont été calculées pour chaque sujet sous forme d'aires supplémentaires sous la courbe (iAUC). Le calcul des iAUC permet différentes valeurs de base individuelles. Les iAUC ont été calculées à l'aide du modèle trapézoïdal, de 0 à 240 min pour le glucose, l'insuline et les BCAA et de 0 à 120 pour le GLP-1 et le GIP. Toutes les valeurs individuelles inférieures à la ligne de base ont été exclues et chaque sujet de l'étude respective était sa propre référence. Les réponses de sécrétion pour le glucose ont été calculées en tant qu'ASC décrémentielle (dAUC) car la réponse est principalement négative. Toutes les valeurs individuelles au-dessus de la ligne de base ont été exclues dans le cas. Les données de comparaison statistique pour l'iAUC et les valeurs individuelles ont été testées pour la normalité et pour les données normalement distribuées, les échantillons ont été comparés à l'aide du modèle linéaire général ANOVA avec la comparaison multiple de Bonferroni pour tester la signification statistique des différences entre les groupes. Le test ANOVA à mesures répétées a été utilisé pour évaluer l'effet du temps pour chaque traitement respectif. L'ANOVA à modèle mixte a été utilisée pour évaluer le traitement et l'effet du temps par rapport au traitement. Les différences entre les groupes ont été identifiées à l'aide des tests de comparaisons multiples de Bonferroni. GraphPad Prism, version 5.03 (logiciel GraphPad, San Diego) a été utilisé pour effectuer toutes les procédures statistiques.