Efeitos da Incretina de Aminoácidos de Cadeia Ramificada

Protocolos do estudo: Três testes foram realizados em ocasiões diferentes (pelo menos 7 dias entre eles). Primeiro teste (teste de BCAA IV) consistiu na aplicação IV de solução de BCAA (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Alemanha; Leucina 43%, Isoleucina 24%, Valina 33%) na dose total de 0,4 g/kg em uma infusão de 2 h (volume médio da solução 1023±34,6mL, dose total média de BCAA 30,7±1,1g) para respeitar a taxa de infusão máxima recomendada. O segundo teste (teste de BCAA ORAL) compreendeu a ingestão oral de uma vez de cápsulas de BCAA (cápsulas de BCAA, Reflex Nutrition, UK, Brighton; Leucina 50%, Isoleucina 25%, Valina 25%) em uma dose única de 0,4 g/kg (média dose total de BCAA 30,7±1,1 g) administrado durante 30s, regado com 500mL de água da torneira. Terceiro teste (teste PLACEBO ORAL) consistiu na ingestão oral de cápsulas de placebo (metilcelulose, preparadas em farmácia de instituição hospitalar universitária) em uma única dose de 0,4 g/kg administrada durante 30 s, lavada com 500 mL de água da torneira. O conteúdo das cápsulas de placebo foi pesado e embalado de forma idêntica às cápsulas de BCAA. Nem os participantes nem a equipe que administrava as cápsulas e realizava o protocolo desconheciam o conteúdo das cápsulas, de modo que as configurações randomizadas e duplo-cegas pudessem ser mantidas.

Análise de sangue: Sangue venoso periférico basal foi coletado de cada indivíduo após 12 h de jejum (-15 min) e depois no tempo 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min durante todo o intervenção. O plasma foi imediatamente separado e todas as amostras foram congeladas a -80 °C até a análise ser realizada. Para análise de GLP-1 e GIP foi utilizado o BD P800 Blood Collection System com revestimento desenvolvido para preservar peptídeos metabólicos no sangue (coquetel de proteases, inibidores de esterase e DPP-IV, anticoagulante 3,6 mg ácido dipotássico etilenodiaminotetracético (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., New Jersey, EUA).

Parâmetros de homeostase da glicose foram avaliados: glicose plasmática usando reação de hexoquinase (analisador Konelab Glucose, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finlândia) e insulina sérica usando imunoensaio enzimático quimioluminescente competitivo em fase sólida (Immulite 2000, Siemens A.G., Alemanha).

Kits ELISA comercialmente disponíveis foram usados ​​para análise de GLP-1 e GIP: para GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japão) e para GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, EUA).

Os níveis séricos de BCAAs foram determinados pelo método de eletroforese capilar (CE) com detecção de condutividade sem contato, que já foi descrito em detalhes [18]. Resumidamente: as medições de CE foram realizadas usando o sistema HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha) equipado com um detector de condutividade sem contato integrado. A separação ocorreu em um capilar de sílica fundida (31,4 cm de comprimento total, 14,7 cm para o detector, 25 μm de diâmetro interno, 363 μm de diâmetro externo, Composite Metal Services, Reino Unido) à temperatura controlada de 25 °C. A superfície interna do capilar é coberta com solução de revestimento INST (Biotaq, EUA) para evitar o fluxo eletro-osmótico antes de seu primeiro uso [19]. A separação CE é realizada em um eletrólito de fundo otimizado com composição 3,2 mol/l ácido acético em 20% v/v metanol, pH 2,0. O tempo de separação alcançado foi de 125 s com intensidade de campo elétrico de 0,96 kV/cm e aplicação simultânea de uma pressão hidrodinâmica de 50 mbar. A eficiência de separação no soro sanguíneo igualou 461.000 placas/m para valina e isoleucina e 455.000 placas/m para leucina; os limites de detecção são iguais a 0,4 µM para todos os três aminoácidos. Os valores do desvio padrão relativo para repetibilidade do tempo de migração foram de 0,1% para medições em um único dia e 0,3% para medições em dias diferentes; os valores de desvio padrão relativo para repetibilidade das áreas de pico igualaram 2,3 - 2,6% para medições durante um único dia e 2,7 - 4,6% para medições em dias diferentes. As amostras de sangue foram coletadas em tubos de ensaio contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). As amostras de soro obtidas foram armazenadas em freezer a -20 °C até a análise. Antes da análise, as amostras de soro descongeladas foram desproteinizadas pela mistura de 250 µl de soro com 750 µl de acetonitrila. A desproteinização foi realizada em tubo Eppendorf após agitação por 30s. Em seguida, as amostras de soro foram centrifugadas a uma aceleração de 4 g por 45 s; 800 µL do sobrenadante obtido foram levados para análise CE.

Análise estatística: Os dados são apresentados em texto, tabelas e figuras como média ± erro padrão da média (SEM) e valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As respostas de secreção para insulina, GIP, GLP-1, valina, leucina e isoleucina foram calculadas para cada indivíduo como áreas incrementais sob a curva (iAUC). O cálculo de iAUCs permite diferentes valores de linha de base individuais. Os iAUCs foram calculados usando o modelo trapezoidal, de 0-240 min para glicose, insulina e BCAA e 0-120 para GLP-1 e GIP. Todos os valores individuais abaixo da linha de base foram excluídos e cada sujeito no respectivo estudo foi sua própria referência. As respostas de secreção para glicose foram calculadas como AUC decremental (dAUC), pois a resposta é predominantemente negativa. Todos os valores individuais acima da linha de base foram excluídos no caso. Os dados para comparação estatística para iAUC e valores individuais foram testados quanto à normalidade e para dados normalmente distribuídos, as amostras foram comparadas usando o modelo linear geral ANOVA com comparação múltipla de Bonferroni para testar a significância estatística das diferenças entre os grupos. O teste ANOVA de medidas repetidas foi usado para avaliar o efeito do tempo para cada tratamento respectivo. ANOVA de modelo misto foi usada para avaliar o efeito do tratamento e tempo versus tratamento. As diferenças entre os grupos foram identificadas por meio dos testes de comparações múltiplas de Bonferroni. GraphPad Prism, versão 5.03 (software GraphPad, San Diego) foi usado para realizar todos os procedimentos estatísticos.