Haaraketjuisten aminohappojen inkretiinivaikutukset

Tutkimusprotokollat: Kolme testiä suoritettiin eri yhteydessä (vähintään 7 päivää välissä). Ensimmäinen testi (IV BCAA-testi) sisälsi BCAA-liuoksen (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Saksa; Leusiini 43%, Isoleusiini 24%, Valiini 33 %) IV annostelun kokonaisannoksena 0,4 g/kg 2 tunnin infuusio (keskimääräinen liuoksen tilavuus 1023±34,6 ml, keskimääräinen BCAA:n kokonaisannos 30,7±1,1 g) suurinta suositeltua infuusionopeutta noudattaen. Toinen testi (ORAL BCAA-testi) käsitti BCAA-kapseleiden (BCAA-kapselit, Reflex Nutrition, UK, Brighton; Leusiini 50%, Isoleusiini 25%, Valiini 25%) kerta-annoksena 0,4 g/kg (keskiarvo) BCAA:n kokonaisannos 30,7±1,1 g) annettuna 30 sekunnin aikana, pestään 500 ml:lla vesijohtovettä. Kolmas testi (ORAL PLACEBO-testi), joka sisälsi lumekapseleiden (metyyliselluloosa, yliopistollisen sairaalan laitoksen apteekki valmisteltu) yhden annoksen 0,4 g/kg nauttimisen kerralla 30 sekunnin aikana, huuhdeltuna 500 ml:lla vesijohtovettä. Lumekapselien sisältö painotettiin ja pakattiin identtisesti BCAA-kapseleiden kanssa. Osallistujat tai kapseleita antaneet ja protokollaa suorittavat henkilöt eivät myöskään tienneet kapseleiden sisällöstä, joten satunnaistetut kaksoissokkoasetukset olisi voitu säilyttää.

Verianalyysi: Perifeerinen laskimoveri otettiin jokaiselta koehenkilöltä 12 tunnin paaston jälkeen (-15 min) ja sitten ajankohtina 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min koko ajan. väliintuloa. Plasma erotettiin välittömästi ja kaikki näytteet jäädytettiin -80 °C:ssa, kunnes analyysi suoritettiin. GLP-1- ja GIP-analyyseihin käytettiin BD P800 Blood Collection System -järjestelmää, jossa oli päällyste, joka oli kehitetty säilyttämään metabolisia peptidejä veressä (cocktaaseja, esteraasi- ja DPP-IV-estäjiä, antikoagulantti 3,6 mg di-kaliumetyleenidiamiinitetraetikkahappoa (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., New Jersey, USA).

Glukoosin homeostaasin parametrit arvioitiin: plasman glukoosi heksokinaasireaktiolla (Konelab Glucose Analyzer, Thermo Fisher Scientific, Oy., Suomi) ja seerumin insuliini käyttämällä kiinteän faasin kompetitiivista kemiluminesenssientsyymi-immunomääritystä (Immulite 2000, Siemens A.G., Saksa).

Kaupallisesti saatavilla olevia ELISA-pakkauksia käytettiin GLP-1- ja GIP-analyysiin: GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japani) ja GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA) varten.

Seerumin BCAA-pitoisuudet määritettiin kapillaarielektroforeesimenetelmällä (CE) kontaktittoman johtavuuden havaitsemisen avulla, joka on jo kuvattu yksityiskohtaisesti [18]. Lyhyesti: CE-mittaukset suoritettiin HP3DCE-järjestelmällä (Agilent Technologies, Waldbronn, Saksa), joka oli varustettu sisäänrakennetulla kosketuksettomalla johtavuusilmaisimella. Erotus tapahtui sulatetun piidioksidin kapillaarissa (kokonaispituus 31,4 cm, 14,7 cm ilmaisimeen, sisähalkaisija 25 μm, ulkohalkaisija 363 μm, Composite Metal Services, UK) valvotussa 25 °C:n lämpötilassa. Kapillaarin sisäpinta peitetään INST-pinnoitusliuoksella (Biotaq, U.S.A.) sähköosmoottisen virtauksen estämiseksi ennen ensimmäistä käyttöä [19]. CE-erotus suoritetaan optimoidussa taustaelektrolyytissä, jonka koostumus on 3,2 mol/l etikkahappoa 20 % tilavuus/tilavuus metanolissa, pH 2,0. Saavutettu erotusaika oli 125 s sähkökentän voimakkuudella 0,96 kV/cm ja samanaikaisesti käytettäessä 50 mbar:n hydrodynaamista painetta. Erotusteho veriseerumissa oli 461 000 levyä/m valiinille ja isoleusiinille ja 455 000 levyä/m leusiinille; havaitsemisrajat ovat 0,4 uM kaikille kolmelle aminohapolle. Migraatioajan toistettavuuden suhteelliset keskihajonnan arvot olivat 0,1 % yhden päivän mittauksissa ja 0,3 % eri päivien mittauksissa; piikkialueiden toistettavuuden suhteelliset keskihajonnan arvot olivat 2,3 - 2,6 % yhden päivän mittauksissa ja 2,7 - 4,6 % eri päivien mittauksissa. Verinäytteet kerättiin koeputkiin, jotka sisälsivät etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA). Saatuja seeruminäytteitä säilytettiin pakastimessa -20 °C:ssa analyysiin asti. Ennen analyysiä jäätymättömät seeruminäytteet poistettiin proteiinista sekoittamalla 250 ui seerumia 750 ul:aan asetonitriiliä. Proteiininpoisto suoritettiin Eppendorf-putkessa 30 sekunnin ravistelun jälkeen. Sitten seeruminäytteet sentrifugoitiin 4 g:n kiihtyvyydellä 45 s; 800 ui saatua supernatanttia otettiin CE-analyysiä varten.

Tilastollinen analyysi: Tiedot on esitetty tekstissä, taulukoissa ja kuvissa keskiarvona ± keskiarvon standardivirhe (SEM), ja arvoja p<0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävinä. Insuliinin, GIP:n, GLP-1:n, valiinin, leusiinin ja isoleusiinin eritysvasteet laskettiin kullekin koehenkilölle käyrän alla olevina inkrementaalisina alueina (iAUC). iAUC-laskenta mahdollistaa erilaiset yksittäiset perusarvot. iAUC:t laskettiin käyttämällä puolisuunnikkaan mallia, 0-240 minuuttia glukoosille, insuliinille ja BCAA:lle ja 0-120 GLP-1:lle ja GIP:lle. Kaikki perusviivan alapuolella olevat yksittäiset arvot suljettiin pois, ja jokainen vastaavassa tutkimuksessa ollut henkilö oli oma referenssinsä. Glukoosin eritysvasteet laskettiin dekrementaalisena AUC:na (dAUC), koska vaste on pääasiassa negatiivinen. Kaikki perusviivan yläpuolella olevat yksittäiset arvot jätettiin tässä tapauksessa pois. Datan tilastollista vertailua varten iAUC:n ja yksittäisten arvojen osalta testattiin normaalia ja normaalisti jakautuneiden tietojen osalta näytteitä verrattiin käyttämällä yleistä lineaarista mallia ANOVA Bonferronin moninkertaiseen vertailuun ryhmien välisten erojen tilastollisen merkitsevyyden testaamiseksi. Toistettujen mittausten ANOVA-testiä käytettiin arvioimaan kunkin vastaavan hoidon aikavaikutus. Sekoitettu malli ANOVA käytettiin arvioimaan hoito ja aika vs hoidon vaikutus. Ryhmien väliset erot tunnistettiin käyttämällä Bonferronin useita vertailutestejä. GraphPad Prism, julkaisu 5.03 (GraphPad-ohjelmisto, San Diego) käytettiin suorittamaan kaikki tilastolliset toimenpiteet.