분지쇄 아미노산의 인크레틴 효과

연구 프로토콜: 3가지 테스트가 다른 경우(최소 7일 간격)에 수행되었습니다. BCAA 용액(Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Germany; Leucine 43%, Isoleucine 24%, Valine 33%)의 총 투여량 0.4g/kg의 IV 적용으로 구성된 첫 번째 테스트(IV BCAA 테스트) 2시간 주입(평균 용액 부피 1023±34.6mL, BCAA의 평균 총 용량 30.7±1.1g) 최대 권장 주입 속도를 준수합니다. 두 번째 테스트(구강 BCAA 테스트)는 BCAA 캡슐(BCAA 캡슐, Reflex Nutrition, UK, Brighton; 류신 50%, 이소류신 25%, 발린 25%)을 0.4g/kg(평균 BCAA 총 투여량 30.7±1.1g)을 30대에 걸쳐 투여하고 수돗물 500mL로 씻어 내었습니다. 3차 테스트(ORAL 플라시보 테스트)는 0.4g/kg의 단일 용량으로 30초에 걸쳐 위약 캡슐(메틸셀룰로오스, 대학병원 약국에서 제조)을 한 번에 경구 섭취하고 500mL의 수돗물로 세척하는 것으로 구성됩니다. 위약 캡슐의 내용물은 BCAA 캡슐과 동일하게 칭량 및 포장되었습니다. 무작위 이중 맹검 설정을 유지할 수 있도록 참가자나 캡슐을 투여하고 프로토콜을 수행하는 직원도 캡슐 내용물에 대해 알지 못했습니다.

혈액 분석: 기초 말초 정맥혈은 12시간의 금식(~15분) 후 각 피험자로부터 채혈한 다음 전체 시간 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240분에 채취했습니다. 간섭. 혈장을 즉시 분리하고 분석을 수행할 때까지 모든 샘플을 -80°C에서 동결했습니다. GLP-1 및 GIP 분석을 위해 BD P800 혈액 수집 시스템을 혈액 내 대사 펩타이드를 보존하기 위해 개발된 코트와 함께 사용했습니다(프로테아제 칵테일, 에스테라아제 및 DPP-IV 억제제, 항응고제 3,6mg 디포타슘 에틸렌디아민테트라아세트산(K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., 미국 뉴저지).

글루코스 항상성의 매개변수를 평가하였다: 헥소키나아제 반응(Konelab Glucose analyzer, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finland)을 사용한 혈장 글루코스 및 고상 경쟁적 화학발광 효소 면역분석법(Immulite 2000, Siemens A.G., Germany)을 사용한 혈청 인슐린.

상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트는 GLP-1 및 GIP 분석에 사용되었습니다 : GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan) 및 GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

BCAA의 혈청 수준은 비접촉식 전도도 검출이 있는 모세관 전기영동(CE) 방법으로 결정되었으며, 이는 이미 자세히 설명되어 있습니다[18]. 곧: 비접촉 전도도 검출기가 내장된 HP3DCE 시스템(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)을 사용하여 CE 측정을 수행했습니다. 분리는 25°C의 제어된 온도에서 용융 실리카 모세관(총 길이 31.4cm, 검출기까지 14.7cm, 내부 직경 25μm, 외부 직경 363μm, Composite Metal Services, UK)에서 발생했습니다. 모세관의 내부 표면은 처음 사용하기 전에 전기 삼투 흐름을 방지하기 위해 INST 코팅 용액(Biotaq, U.S.A.)을 사용하여 덮습니다[19]. CE 분리는 pH 2.0, 20% v/v 메탄올 중 3.2 mol/l 아세트산 조성을 갖는 최적화된 백그라운드 전해질에서 수행됩니다. 달성된 분리 시간은 0.96 kV/cm의 전계 강도와 50 mbar의 유체 역학 압력의 동시 적용에서 125초였습니다. 혈청의 분리 효율은 발린과 이소류신의 경우 461,000 plate/m, 류신의 경우 455,000 plates/m와 같았습니다. 검출 한계는 세 가지 아미노산 모두에 대해 0.4 μM과 같습니다. 마이그레이션 시간의 반복성에 대한 상대 표준 편차 값은 하루 측정의 경우 0.1%, 다른 날 측정의 경우 0.3%였습니다. 피크 영역의 반복성에 대한 상대 표준 편차 값은 하루 측정의 경우 2.3 - 2.6%, 다른 날 측정의 경우 2.7 - 4.6%였습니다. 혈액 샘플은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이 들어 있는 시험관에 수집되었습니다. 얻어진 혈청 샘플은 분석 전까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다. 분석에 앞서, 동결되지 않은 혈청 샘플은 250μl의 혈청과 750μL의 아세토니트릴을 혼합하여 단백질을 제거했습니다. 단백질 제거는 30초 동안 진탕한 후 Eppendorf 튜브에서 수행되었습니다. 그런 다음 혈청 샘플을 45초 동안 4g의 가속도에서 원심분리했습니다. 얻어진 상청액 800μL를 CE 분석에 사용하였다.

통계 분석: 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 텍스트, 표 및 그림으로 표시되며 p<0.05 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. 인슐린, GIP, GLP-1, 발린, 류신 및 이소류신에 대한 분비 반응은 곡선 아래 증분 면적(iAUC)으로서 각 피험자에 대해 계산되었습니다. iAUCs 계산은 서로 다른 개별 기준 값을 허용합니다. iAUC는 사다리꼴 모델을 사용하여 포도당, 인슐린 및 BCAA의 경우 0-240분, GLP-1 및 GIP의 경우 0-120분으로 계산되었습니다. 기준선 아래의 모든 개별 값은 제외되었으며 각 연구의 각 피험자는 자신의 참고 자료였습니다. 포도당에 대한 분비 반응은 반응이 주로 음성이므로 감소 AUC(dAUC)로 계산되었습니다. 기준선 위의 모든 개별 값은 사례에서 제외되었습니다. iAUC에 대한 통계적 비교를 위한 데이터와 개별 값이 정규성을 테스트하고 정규 분포 데이터에 대해 샘플을 일반 선형 모델 ANOVA와 Bonferroni의 다중 비교를 사용하여 비교하여 그룹 간 차이의 통계적 유의성을 테스트했습니다. 반복 측정 ANOVA 테스트를 사용하여 모든 개별 치료에 대한 시간 효과를 평가했습니다. 혼합 모델 ANOVA를 사용하여 치료 및 시간 대 치료 효과를 평가했습니다. 그룹 간의 차이는 Bonferroni의 다중 비교 테스트를 사용하여 확인되었습니다. GraphPad Prism, 릴리스 5.03(GraphPad 소프트웨어, San Diego)을 사용하여 모든 통계 절차를 수행했습니다.