Inkretin-Effekte von verzweigtkettigen Aminosäuren

Studienprotokolle: Drei Tests wurden zu unterschiedlichen Anlässen durchgeführt (mindestens 7 Tage dazwischen). Erster Test (IV-BCAA-Test) bestehend aus der IV-Applikation einer BCAA-Lösung (Nutramin VLI 3 %, Fresenius Kabi, KGaA, Deutschland; Leucin 43 %, Isoleucin 24 %, Valin 33 %) in einer Gesamtdosis von 0,4 g/kg in eine 2-stündige Infusion (mittleres Lösungsvolumen 1023 ± 34,6 ml, mittlere BCAA-Gesamtdosis 30,7 ± 1,1 g), um die maximal empfohlene Infusionsrate einzuhalten. Zweiter Test (ORAL BCAA-Test) bestehend aus der sofortigen oralen Einnahme von BCAA-Kapseln (BCAA-Kapseln, Reflex Nutrition, UK, Brighton; Leucin 50 %, Isoleucin 25 %, Valin 25 %) in einer Einzeldosis von 0,4 g/kg (Durchschnitt Gesamtdosis BCAA 30,7 ± 1,1 g), verabreicht über 30 Sekunden, mit 500 ml Leitungswasser heruntergespült. Dritter Test (ORAL PLACEBO-Test) bestehend aus der sofortigen oralen Einnahme von Placebo-Kapseln (Methylcellulose, Apotheke der Universitätsklinik hergestellt) in einer Einzeldosis von 0,4 g/kg, verabreicht über 30 s, heruntergespült mit 500 ml Leitungswasser. Der Inhalt von Placebo-Kapseln wurde gewogen und identisch mit BCAA-Kapseln verpackt. Weder die Teilnehmer noch das Personal, das die Kapseln verabreicht und das Protokoll durchführt, wussten nichts über den Inhalt der Kapseln, so dass randomisierte doppelblinde Einstellungen beibehalten werden konnten.

Blutanalyse: Basales peripheres venöses Blut wurde jedem Probanden nach 12 h Fasten (–15 min) und dann während der gesamten Zeit zu den Zeiten 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min entnommen Intervention. Das Plasma wurde sofort abgetrennt und alle Proben wurden bei –80°C eingefroren, bis die Analyse durchgeführt wurde. Für die GLP-1- und GIP-Analyse wurde das BD P800 Blood Collection System mit einer Beschichtung verwendet, die entwickelt wurde, um metabolische Peptide im Blut zu konservieren (Cocktail aus Proteasen, Esterase und DPP-IV-Inhibitoren, Antikoagulans 3,6 mg Dikaliumethylendiamintetraessigsäure (K2EDTA), Becton , Dickinson und Co., New Jersey, USA).

Parameter der Glukosehomöostase wurden bewertet: Plasmaglukose unter Verwendung einer Hexokinase-Reaktion (Konelab-Glukoseanalysator, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finnland) und Seruminsulin unter Verwendung eines kompetitiven Festphasen-Chemilumineszenz-Enzym-Immunassays (Immulite 2000, Siemens A.G., Deutschland).

Kommerziell erhältliche ELISA-Kits wurden für die GLP-1- und GIP-Analyse verwendet: für GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan) und für GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

Serumspiegel von BCAAs wurden durch die Methode der Kapillarelektrophorese (CE) mit berührungsloser Leitfähigkeitsdetektion bestimmt, die bereits ausführlich beschrieben wurde [18]. In Kürze: CE-Messungen wurden mit einem HP3DCE-System (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) durchgeführt, das mit einem eingebauten kontaktlosen Leitfähigkeitsdetektor ausgestattet war. Die Trennung erfolgte in einer Fused-Silica-Kapillare (31,4 cm Gesamtlänge, 14,7 cm zum Detektor, 25 μm Innendurchmesser, 363 μm Außendurchmesser, Composite Metal Services, UK) bei einer kontrollierten Temperatur von 25 °C. Die Innenfläche der Kapillare wird mit INST-Beschichtungslösung (Biotaq, USA) bedeckt, um einen elektroosmotischen Fluss vor ihrer ersten Verwendung zu verhindern [19]. Die CE-Trennung wird in einem optimierten Hintergrundelektrolyten mit der Zusammensetzung 3,2 mol/l Essigsäure in 20 % v/v Methanol, pH 2,0 durchgeführt. Die erreichte Trennzeit betrug 125 s bei einer elektrischen Feldstärke von 0,96 kV/cm und gleichzeitigem Anlegen eines hydrodynamischen Drucks von 50 mbar. Die Trennleistung im Blutserum betrug 461.000 Platten/m für Valin und Isoleucin und 455.000 Platten/m für Leucin; die Nachweisgrenzen betragen für alle drei Aminosäuren 0,4 µM. Die relativen Standardabweichungswerte für die Wiederholbarkeit der Migrationszeit betrugen 0,1 % für Messungen an einem einzigen Tag und 0,3 % für Messungen an verschiedenen Tagen; die relativen Standardabweichungswerte für die Wiederholbarkeit der Peakflächen betrugen 2,3 - 2,6 % für Messungen an einem einzigen Tag und 2,7 - 4,6 % für Messungen an verschiedenen Tagen. Blutproben wurden in Reagenzgläsern gesammelt, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthielten. Die erhaltenen Serumproben wurden bis zur Analyse in einem Gefrierschrank bei -20 °C gelagert. Vor der Analyse wurden die ungefrorenen Serumproben durch Mischen von 250 &mgr;l Serum mit 750 &mgr;l Acetonitril deproteinisiert. Die Deproteinisierung wurde in einem Eppendorf-Röhrchen nach 30-sekündigem Schütteln durchgeführt. Dann wurden die Serumproben bei einer Beschleunigung von 4 g für 45 s zentrifugiert; 800 &mgr;l des erhaltenen Überstands wurden für die CE-Analyse entnommen.

Statistische Analyse: Die Daten werden in Text, Tabellen und Abbildungen als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt und Werte von p < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet. Die Sekretionsreaktionen für Insulin, GIP, GLP-1, Valin, Leucin und Isoleucin wurden für jede Person als inkrementelle Flächen unter der Kurve (iAUC) berechnet. Die iAUCs-Berechnung berücksichtigt unterschiedliche individuelle Ausgangswerte. iAUCs wurden unter Verwendung des Trapezmodells von 0–240 min für Glucose, Insulin und BCAA und 0–120 für GLP-1 und GIP berechnet. Alle individuellen Werte unterhalb der Grundlinie wurden ausgeschlossen und jedes Subjekt in der jeweiligen Studie war seine eigene Referenz. Die Sekretionsreaktionen für Glucose wurden als dekrementelle AUC (dAUC) berechnet, da die Reaktion überwiegend negativ ist. Alle Einzelwerte oberhalb der Baseline wurden dabei ausgeschlossen. Daten für den statistischen Vergleich für iAUC und individuelle Werte wurden auf Normalität getestet und für normalverteilte Daten wurden Proben unter Verwendung des allgemeinen linearen Modells ANOVA mit Mehrfachvergleich nach Bonferroni verglichen, um die statistische Signifikanz von Unterschieden zwischen Gruppen zu testen. Der ANOVA-Test mit wiederholten Messungen wurde verwendet, um den Zeiteffekt für jede jeweilige Behandlung zu bewerten. Gemischte Modell-ANOVA wurde verwendet, um die Behandlung und den Zeit-gegen-Behandlungseffekt zu bewerten. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung von Mehrfachvergleichstests von Bonferroni identifiziert. GraphPad Prism, Version 5.03 (GraphPad-Software, San Diego) wurde verwendet, um alle statistischen Verfahren durchzuführen.