Inkretineffekter av forgrenede aminosyrer

Studieprotokoller: Tre tester ble utført ved en annen anledning (minst 7 dager i mellom). Første test (IV BCAA-test) besto av IV-påføring av BCAA-løsning (Nutramin VLI 3 %, Fresenius Kabi, KGaA, Tyskland; Leucin 43 %, Isoleucin 24 %, Valin 33 %) i totaldose på 0,4 g/kg i en 2 timers infusjon (gjennomsnittlig oppløsningsvolum 1023±34,6 ml, gjennomsnittlig totaldose av BCAA 30,7±1,1g) for å respektere maksimal anbefalt infusjonshastighet. Andre test (ORAL BCAA-test) besto av samtidig oralt inntak av BCAA-kapsler (BCAA-kapsler, Reflex Nutrition, Storbritannia, Brighton; Leucin 50 %, Isoleucin 25 %, Valine 25 %) i en enkeltdose på 0,4 g/kg (gjennomsnittlig total dose av BCAA 30,7±1,1 g) administrert over 30s, vasket ned med 500mL springvann. Tredje test (ORAL PLACEBO-test) bestod av samtidig oralt inntak av placebokapsler (metylcellulose, tilberedt universitetssykehusinstitusjon) i en enkeltdose på 0,4 g/kg administrert over 30 s, vasket ned med 500 ml vann fra springen. Innholdet i placebokapsler ble vektet og pakket identisk med BCAA-kapsler. Verken deltakerne eller personalet som administrerte kapsler og utførte protokollen visste ikke om kapselinnholdet slik at randomiserte dobbeltblindede innstillinger kunne ha blitt opprettholdt.

Blodanalyse: Basalt perifert veneblod ble trukket fra hvert individ etter 12 timers faste (-15 minutter) og deretter til tiden 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 minutter gjennom hele innblanding. Plasma ble umiddelbart separert og alle prøver ble frosset ved -80 °C inntil analyse ble utført. For GLP-1 og GIP-analyse ble BD P800 blodprøvetakingssystem brukt med pels utviklet for å bevare metabolske peptider i blod (cocktail av proteaser, esterase- og DPP-IV-hemmere, antikoagulant 3,6 mg di-kaliumetylendiamintetraeddiksyre (K2EDTA), Becton , Dickinson og Co., New Jersey, USA).

Parametre for glukosehomeostase ble vurdert: plasmaglukose ved bruk av heksokinase-reaksjon (Konelab Glucose-analysator, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finland) og seruminsulin ved bruk av solidfase-konkurrerende kjemiluminescerende enzymimmunoassay (Immulite 2000, Siemens A.G., Tyskland).

Kommersielt tilgjengelige ELISA-sett ble brukt for GLP-1 og GIP-analyse: for GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan) og for GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

Serumnivåer av BCAA ble bestemt ved metode for kapillærelektroforese (CE) med kontaktløs konduktivitetsdeteksjon, som allerede er beskrevet i detaljer [18]. Kort tid: CE-målinger ble utført ved hjelp av HP3DCE-systemet (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland) utstyrt med en innebygd kontaktløs konduktivitetsdetektor. Separasjon fant sted i en kapillær med smeltet silika (31,4 cm i total lengde, 14,7 cm til detektor, 25 μm innvendig diameter, 363 μm ytre diameter, Composite Metal Services, Storbritannia) ved den kontrollerte temperaturen på 25 °C. Den indre overflaten av kapillæren er dekket med INST-beleggsløsning (Biotaq, U.S.A.) for å forhindre elektroosmotisk strømning før den brukes første gang [19]. CE-separasjonen utføres i en optimalisert bakgrunnselektrolytt med sammensetning 3,2 mol/l eddiksyre i 20 % v/v metanol, pH 2,0. Den oppnådde separasjonstiden var 125 s ved elektrisk feltintensitet på 0,96 kV/cm og samtidig påføring av et hydrodynamisk trykk på 50 mbar. Separasjonseffektiviteten i blodserum tilsvarte 461 000 plater/m for valin og isoleucin, og 455 000 plater/m for leucin; deteksjonsgrensene er lik 0,4 µM for alle tre aminosyrene. De relative standardavviksverdiene for repeterbarhet av migrasjonstiden tilsvarte 0,1 % for målinger i løpet av en enkelt dag og 0,3 % for målinger på forskjellige dager; de relative standardavviksverdiene for repeterbarhet av toppområdene tilsvarte 2,3 - 2,6 % for målinger i løpet av en enkelt dag og 2,7 - 4,6 % for målinger på forskjellige dager. Blodprøver ble samlet i reagensglass som inneholdt etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). De oppnådde serumprøvene ble lagret i en fryser ved -20 °C frem til analysen. Før analysen ble de ufrosne serumprøvene deproteinisert ved å blande 250 µl serum med 750 µL acetonitril. Deproteinisering ble utført i et Eppendorf-rør etter risting i 30 sekunder. Deretter ble serumprøvene sentrifugert med en akselerasjon på 4 g i 45 s; 800 µL av den oppnådde supernatanten ble tatt for CE-analyse.

Statistisk analyse: Data presenteres i tekst, tabeller og figurer som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) og verdier på p<0,05 ble ansett som statistisk signifikante. Sekresjonsresponser for insulin, GIP, GLP-1, valin, leucin og isoleucin ble beregnet for hvert individ som inkrementelle områder under kurven (iAUC). iAUCs-beregning tillater forskjellige individuelle grunnlinjeverdier. iAUCs ble beregnet ved hjelp av trapesmodellen, fra 0-240 minutter for glukose, insulin og BCAA og 0-120 for GLP-1 og GIP. Alle individuelle verdier under grunnlinjen ble ekskludert og hvert individ i respektive studie var sin egen referanse. Sekresjonsresponser for glukose ble beregnet som dekrementell AUC (dAUC) da responsen overveiende er negativ. Alle individuelle verdier over grunnlinjen ble ekskludert i saken. Data for statistisk sammenligning for iAUC og individuelle verdier ble testet for normalitet og for normalfordelte data ble prøver sammenlignet ved bruk av generell lineær modell ANOVA med Bonferronis multiple sammenligning for å teste den statistiske signifikansen av forskjeller mellom grupper. Gjentatte tiltak ANOVA-test ble brukt for å vurdere tidseffekt for hver respektive behandling. Blandet modell ANOVA ble brukt for å vurdere behandling og tid vs behandlingseffekt. Forskjeller mellom grupper ble identifisert ved hjelp av Bonferronis multiple sammenligningstester. GraphPad Prism, utgave 5.03 (GraphPad-programvare, San Diego) ble brukt til å utføre alle statistiske prosedyrer.