Inkretineffekter af forgrenede aminosyrer

Undersøgelsesprotokoller: Tre test blev udført ved en anden lejlighed (mindst 7 dage imellem). Første test (IV BCAA-test) bestod af IV-påføring af BCAA-opløsning (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Tyskland; Leucin 43%, Isoleucin 24%, Valine 33%) i total dosis på 0,4 g/kg i en 2 timers infusion (gennemsnitlig opløsningsvolumen 1023±34,6 ml, gennemsnitlig total dosis af BCAA 30,7±1,1g) for at respektere den maksimale anbefalede infusionshastighed. Anden test (ORAL BCAA-test) bestod af på én gang oral indtagelse af BCAA-kapsler (BCAA-kapsler, Reflex Nutrition, UK, Brighton; Leucin 50 %, Isoleucin 25 %, Valine 25 %) i en enkelt dosis på 0,4 g/kg (gennemsnitlig total dosis BCAA 30,7±1,1 g) administreret over 30 sekunder, vasket ned med 500 ml postevand. Tredje test (ORAL PLACEBO-test) bestod af på én gang oral indtagelse af placebokapsler (methylcellulose, tilberedt universitetshospitalinstitution) i en enkelt dosis på 0,4 g/kg administreret over 30 s, skyllet ned med 500 ml postevand. Indholdet af placebo-kapsler blev vægtet og pakket identisk med BCAA-kapsler. Hverken deltagerne eller personalet, der administrerede kapsler og udførte protokollen, kendte ikke til kapslernes indhold, således at randomiserede dobbeltblindede indstillinger kunne have været opretholdt.

Blodanalyse: Basalt perifert veneblod blev udtaget fra hvert forsøgsperson efter 12 timers faste (-15 min) og derefter på tidspunktet 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min. intervention. Plasma blev straks adskilt, og alle prøver blev frosset ved -80 °C, indtil analyse blev udført. Til GLP-1 og GIP analyse blev BD P800 Blood Collection System brugt med pels udviklet til at bevare metaboliske peptider i blod (cocktail af proteaser, esterase og DPP-IV hæmmere, antikoagulant 3,6 mg di-kaliumethylendiamintetraeddikesyre (K2EDTA), Becton , Dickinson og Co., New Jersey, USA).

Parametre for glucosehomeostase blev vurderet: plasmaglucose under anvendelse af hexokinasereaktion (Konelab Glucoseanalysator, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finland) og seruminsulin ved anvendelse af fastfase-konkurrerende kemiluminescerende enzymimmunoassay (Immulite 2000, Siemens A.G., Tyskland).

Kommercielt tilgængelige ELISA-sæt blev brugt til GLP-1 og GIP-analyse: til GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan) og til GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

Serumniveauer af BCAA'er blev bestemt ved en metode til kapillær elektroforese (CE) med kontaktløs ledningsevnedetektion, som allerede er blevet beskrevet i detaljer [18]. Kort: CE-målinger blev udført ved hjælp af HP3DCE-systemet (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland) udstyret med en indbygget kontaktløs ledningsevnedetektor. Adskillelse fandt sted i en smeltet silicakapillar (31,4 cm i total længde, 14,7 cm til detektor, 25 μm indvendig diameter, 363 μm udvendig diameter, Composite Metal Services, UK) ved den kontrollerede temperatur på 25 °C. Den indvendige overflade af kapillæren er dækket med INST coating-opløsning (Biotaq, U.S.A.) for at forhindre elektroosmotisk strømning før dens første brug [19]. CE-separationen udføres i en optimeret baggrundselektrolyt med sammensætning 3,2 mol/l eddikesyre i 20% v/v methanol, pH 2,0. Den opnåede adskillelsestid var 125 s ved elektrisk feltintensitet på 0,96 kV/cm og samtidig påføring af et hydrodynamisk tryk på 50 mbar. Separationseffektiviteten i blodserum svarede til 461.000 plader/m for valin og isoleucin og 455.000 plader/m for leucin; detektionsgrænserne er lig med 0,4 µM for alle tre aminosyrer. De relative standardafvigelsesværdier for repeterbarhed af migrationstiden svarede til 0,1 % for målinger i løbet af en enkelt dag og 0,3 % for målinger på forskellige dage; de relative standardafvigelsesværdier for repeterbarhed af toparealerne var lig med 2,3 - 2,6 % for målinger i løbet af en enkelt dag og 2,7 - 4,6 % for målinger på forskellige dage. Blodprøver blev opsamlet i reagensglas indeholdende ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). De opnåede serumprøver blev opbevaret i en fryser ved -20 °C indtil analysen. Forud for analysen blev de ufrosne serumprøver deproteiniseret ved at blande 250 µl serum med 750 µL acetonitril. Deproteinisering blev udført i et Eppendorf-rør efter rystning i 30 sekunder. Derefter blev serumprøverne centrifugeret ved en acceleration på 4 g i 45 s; 800 µL af den opnåede supernatant blev taget til CE-analyse.

Statistisk analyse: Data præsenteres i tekst, tabeller og figurer som middelværdier ± standardfejl af middelværdien (SEM), og værdier på p<0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. Sekretionsresponser for insulin, GIP, GLP-1, valin, leucin og isoleucin blev beregnet for hvert individ som inkrementelle arealer under kurven (iAUC). iAUCs-beregning giver mulighed for forskellige individuelle basislinjeværdier. iAUC'er blev beregnet ved hjælp af trapezmodellen, fra 0-240 minutter for glucose, insulin og BCAA og 0-120 for GLP-1 og GIP. Alle individuelle værdier under basislinjen blev udelukket, og hvert individ i den respektive undersøgelse var deres egen reference. Sekretionsresponser for glucose blev beregnet som dekrementel AUC (dAUC), da responsen overvejende er negativ. Alle individuelle værdier over basislinjen blev udelukket i sagen. Data til statistisk sammenligning for iAUC og individuelle værdier blev testet for normalitet, og for normalfordelte data blev prøver sammenlignet ved brug af generel lineær model ANOVA med Bonferronis multiple sammenligning for at teste den statistiske signifikans af forskelle mellem grupper. Gentagne målinger ANOVA-test blev brugt til at vurdere tidseffekten for hver respektive behandling. Blandet model ANOVA blev brugt til at vurdere behandling og tid vs behandlingseffekt. Forskelle mellem grupper blev identificeret ved hjælp af Bonferronis multiple sammenligningstest. GraphPad Prism, version 5.03 (GraphPad-software, San Diego) blev brugt til at udføre alle statistiske procedurer.