Incretine-effecten van aminozuren met vertakte keten

Studieprotocollen: Er werden drie tests uitgevoerd bij een andere gelegenheid (minstens 7 dagen ertussen). Eerste test (IV BCAA-test) bestaande uit IV toepassing van BCAA-oplossing (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Duitsland; Leucine 43%, Isoleucine 24%, Valine 33%) in een totale dosis van 0,4 g/kg in een infusie van 2 uur (gemiddeld oplossingsvolume 1023 ± 34,6 ml, gemiddelde totale dosis BCAA 30,7 ± 1,1 g) om de maximale aanbevolen infusiesnelheid te respecteren. Tweede test (ORALE BCAA-test) bestaande uit onmiddellijke orale inname van BCAA-capsules (BCAA-capsules, Reflex Nutrition, VK, Brighton; Leucine 50%, Isoleucine 25%, Valine 25%) in een enkele dosis van 0,4 g/kg (gemiddeld totale dosis BCAA 30,7 ± 1,1 g) toegediend gedurende 30 seconden, weggespoeld met 500 ml kraanwater. Derde test (ORALE PLACEBO-test) bestaande uit onmiddellijke orale inname van placebocapsules (methylcellulose, apotheekbereiding van de universiteitsziekenhuisinstelling) in een enkele dosis van 0,4 g/kg toegediend gedurende 30 seconden, weggespoeld met 500 ml kraanwater. De inhoud van placebocapsules werd op identieke wijze gewogen en verpakt als BCAA-capsules. Noch de deelnemers, noch het personeel dat de capsules toediende en het protocol uitvoerde, was niet op de hoogte van de inhoud van de capsules, zodat gerandomiseerde dubbelblinde instellingen konden worden gehandhaafd.

Bloedanalyse: Basaal perifeer veneus bloed werd bij elke proefpersoon afgenomen na 12 uur vasten (-15 min) en vervolgens op tijd 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 min gedurende de interventie. Plasma werd onmiddellijk gescheiden en alle monsters werden ingevroren bij -80°C totdat analyse werd uitgevoerd. Voor GLP-1- en GIP-analyse werd het BD P800-bloedafnamesysteem gebruikt met een omhulsel dat is ontwikkeld om metabole peptiden in het bloed te bewaren (cocktail van proteasen, esterase en DPP-IV-remmers, antistollingsmiddel 3,6 mg dikaliumethyleendiaminetetra-azijnzuur (K2EDTA), Becton , Dickinson and Co., New Jersey, VS).

Parameters van glucosehomeostase werden beoordeeld: plasmaglucose met behulp van hexokinasereactie (Konelab Glucose-analysator, Thermo Fisher Scientific, Oy., Finland) en seruminsuline met behulp van competitieve chemoluminescente enzymimmunoassay in de vaste fase (Immulite 2000, Siemens A.G., Duitsland).

In de handel verkrijgbare ELISA-kits werden gebruikt voor GLP-1- en GIP-analyse: voor GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan) en voor GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, VS).

Serumniveaus van BCAA's werden bepaald door middel van capillaire elektroforese (CE) met contactloze geleidbaarheidsdetectie, die al in detail is beschreven [18]. Kort gezegd: CE-metingen werden uitgevoerd met behulp van het HP3DCE-systeem (Agilent Technologies, Waldbronn, Duitsland) uitgerust met een ingebouwde contactloze geleidbaarheidsdetector. Scheiding vond plaats in een capillair van gesmolten silica (31,4 cm totale lengte, 14,7 cm tot detector, 25 μm binnendiameter, 363 μm buitendiameter, Composite Metal Services, VK) bij een gecontroleerde temperatuur van 25 °C. Het binnenoppervlak van het capillair is bedekt met INST-coatingoplossing (Biotaq, VS) om elektro-osmotische stroming te voorkomen vóór het eerste gebruik [19]. De CE-scheiding wordt uitgevoerd in een geoptimaliseerde achtergrondelektrolyt met een samenstelling van 3,2 mol/l azijnzuur in 20% v/v methanol, pH 2,0. De bereikte scheidingstijd was 125 s bij een elektrische veldintensiteit van 0,96 kV/cm en gelijktijdige toepassing van een hydrodynamische druk van 50 mbar. De scheidingsefficiëntie in bloedserum was gelijk aan 461.000 platen/m2 voor valine en isoleucine en 455.000 platen/m2 voor leucine; de detectiegrenzen zijn gelijk aan 0,4 µM voor alle drie de aminozuren. De relatieve standaarddeviatiewaarden voor herhaalbaarheid van de migratietijd bedroegen 0,1% voor metingen gedurende één dag en 0,3% voor metingen op verschillende dagen; de relatieve standaarddeviatiewaarden voor herhaalbaarheid van de piekgebieden bedroegen 2,3 - 2,6% voor metingen gedurende één dag en 2,7 - 4,6% voor metingen op verschillende dagen. Bloedmonsters werden verzameld in reageerbuizen die ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bevatten. De verkregen serummonsters werden tot de analyse in een vriezer bij -20°C bewaard. Voorafgaand aan de analyse werden de niet-ingevroren serummonsters van eiwitten ontdaan door 250 µl serum te mengen met 750 µl acetonitril. Deproteïnisatie werd uitgevoerd in een Eppendorf-buis na 30 seconden schudden. Vervolgens werden de serummonsters gedurende 45 seconden gecentrifugeerd met een versnelling van 4 g; 800 µl van het verkregen supernatant werd genomen voor CE-analyse.

Statistische analyse: gegevens worden gepresenteerd in tekst, tabellen en figuren als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) en waarden van p<0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Secretieresponsen voor insuline, GIP, GLP-1, valine, leucine en isoleucine werden voor elke proefpersoon berekend als incrementele gebieden onder de curve (iAUC). De berekening van iAUC's staat verschillende individuele basislijnwaarden toe. iAUC's werden berekend met behulp van het trapeziummodel, van 0-240 min voor glucose, insuline en BCAA en 0-120 voor GLP-1 en GIP. Alle individuele waarden onder de basislijn werden uitgesloten en elke proefpersoon in de betreffende studie was hun eigen referentie. Secretieresponsen voor glucose werden berekend als decrementele AUC (dAUC) aangezien de respons overwegend negatief is. Alle individuele waarden boven de basislijn werden in de casus uitgesloten. Gegevens voor statistische vergelijking voor iAUC en individuele waarden werden getest op normaliteit en voor normaal verdeelde gegevens werden steekproeven vergeleken met behulp van algemeen lineair model ANOVA met Bonferroni's meervoudige vergelijking om de statistische significantie van verschillen tussen groepen te testen. Herhaalde metingen ANOVA-test werd gebruikt om het tijdseffect voor elke respectieve behandeling te beoordelen. ANOVA met gemengd model werd gebruikt om het effect van behandeling en tijd versus behandeling te beoordelen. Verschillen tussen groepen werden geïdentificeerd met behulp van Bonferroni's meervoudige vergelijkingstests. GraphPad Prism, release 5.03 (GraphPad-software, San Diego) werd gebruikt om alle statistische procedures uit te voeren.