Инкретиновые эффекты аминокислот с разветвленной цепью

Протоколы исследования: Три теста были проведены в разное время (с интервалом не менее 7 дней). Первый тест (IV тест BCAA) состоял из внутривенного применения раствора BCAA (Nutramin VLI 3%, Fresenius Kabi, KGaA, Германия; лейцин 43%, изолейцин 24%, валин 33%) в общей дозе 0,4 г/кг в 2-часовая инфузия (средний объем раствора 1023±34,6 мл, средняя общая доза BCAA 30,7 ± 1,1 г) при соблюдении максимальной рекомендуемой скорости инфузии. Второй тест (тест ORAL BCAA) состоял из однократного перорального приема капсул BCAA (капсулы BCAA, Reflex Nutrition, Великобритания, Брайтон; лейцин 50%, изолейцин 25%, валин 25%) в разовой дозе 0,4 г/кг (средняя общая доза BCAA 30,7±1,1 г) вводится в течение 30 с, запивается 500 мл водопроводной воды. Третий тест (тест ORAL PLACEBO) состоял из однократного перорального приема капсул плацебо (метилцеллюлоза, приготовленная в аптеке университетской больницы) в разовой дозе 0,4 г/кг, вводимых в течение 30 с, запиваемых 500 мл водопроводной воды. Содержимое капсул плацебо взвешивали и упаковывали так же, как и капсулы BCAA. Ни участники, ни персонал, вводивший капсулы и выполнявший протокол, не знали о содержании капсул, поэтому можно было сохранить рандомизированные двойные слепые настройки.

Анализ крови: базальную периферическую венозную кровь брали у каждого испытуемого через 12 ч голодания (-15 мин), а затем в моменты времени 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 мин на протяжении всего исследования. вмешательство. Плазму немедленно отделяли, и все образцы замораживали при -80°C до проведения анализа. Для анализа GLP-1 и GIP использовали систему забора крови BD P800 с оболочкой, разработанной для сохранения метаболических пептидов в крови (коктейль из протеаз, ингибиторов эстеразы и ДПП-IV, антикоагулянт 3,6 мг дикалийэтилендиаминтетрауксусной кислоты (К2ЭДТА), Becton , Dickinson and Co., Нью-Джерси, США).

Оценивали параметры гомеостаза глюкозы: глюкозу плазмы с помощью гексокиназной реакции (анализатор глюкозы Konelab, Thermo Fisher Scientific, Oy., Финляндия) и инсулин сыворотки с помощью твердофазного конкурентного хемилюминесцентного иммуноферментного анализа (Immulite 2000, Siemens A.G., Германия).

Для анализа GLP-1 и GIP использовали коммерчески доступные наборы ELISA: для GLP-1 Immuno-Biological Laboratories (Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan) и для GIP Millipore (EMD Millipore Corporation, Bilerica, MA, USA).

Уровни BCAA в сыворотке определяли методом капиллярного электрофореза (КЭ) с бесконтактным определением электропроводности, который уже подробно описан [18]. Кратко: измерения КЭ проводились с использованием системы HP3DCE (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany), оснащенной встроенным бесконтактным детектором проводимости. Разделение происходило в капилляре из плавленого кварца (31,4 см общей длины, 14,7 см до детектора, внутренний диаметр 25 мкм, внешний диаметр 363 мкм, Composite Metal Services, Великобритания) при контролируемой температуре 25 °C. Внутренняя поверхность капилляра покрыта раствором для покрытия INST (Biotaq, США) для предотвращения электроосмотического потока перед его первым использованием [19]. Разделение КЭ проводят в оптимизированном фоновом электролите состава 3,2 моль/л уксусной кислоты в 20% об./об. метаноле, рН 2,0. Достигнутое время разделения составило 125 с при напряженности электрического поля 0,96 кВ/см и одновременном приложении гидродинамического давления 50 мбар. Эффективность разделения в сыворотке крови составила для валина и изолейцина 461 000 пл/м, для лейцина – 455 000 пл/м; пределы обнаружения равны 0,4 мкМ для всех трех аминокислот. Значения относительного стандартного отклонения повторяемости времени миграции составили 0,1 % для измерений в течение одного дня и 0,3 % для измерений в разные дни; значения относительного стандартного отклонения повторяемости площадей пиков составили 2,3 - 2,6 % для измерений в течение одного дня и 2,7 - 4,6 % для измерений в разные дни. Образцы крови собирали в пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Полученные образцы сыворотки хранили в морозильной камере при -20°С до проведения анализа. Перед анализом размороженные образцы сыворотки депротеинизировали путем смешивания 250 мкл сыворотки с 750 мкл ацетонитрила. Депротеинизацию проводили в пробирке Эппендорфа после встряхивания в течение 30 с. Затем образцы сыворотки центрифугировали при ускорении 4 g в течение 45 с; Для анализа КЭ отбирали 800 мкл полученного супернатанта.

Статистический анализ: данные представлены в тексте, таблицах и рисунках как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), а значения p<0,05 считались статистически значимыми. Реакции секреции инсулина, GIP, GLP-1, валина, лейцина и изолейцина рассчитывали для каждого субъекта в виде возрастающих площадей под кривой (iAUC). Расчет iAUC позволяет использовать различные индивидуальные базовые значения. iAUC рассчитывали с использованием трапециевидной модели, от 0 до 240 минут для глюкозы, инсулина и BCAA и от 0 до 120 минут для GLP-1 и GIP. Все индивидуальные значения ниже исходного уровня были исключены, и каждый субъект в соответствующем исследовании был собственным эталоном. Ответы секреции на глюкозу рассчитывали как декрементную AUC (dAUC), так как ответ преимущественно отрицательный. В данном случае исключались все отдельные значения выше исходного уровня. Данные для статистического сравнения для iAUC и индивидуальных значений проверяли на нормальность, а для нормально распределенных данных выборки сравнивали с использованием общей линейной модели ANOVA с множественным сравнением Бонферрони для проверки статистической значимости различий между группами. Тест повторных измерений ANOVA использовался для оценки временного эффекта для каждого соответствующего лечения. Смешанная модель ANOVA использовалась для оценки лечения и времени по сравнению с эффектом лечения. Различия между группами выявляли с помощью теста множественных сравнений Бонферрони. Для выполнения всех статистических процедур использовали GraphPad Prism, выпуск 5.03 (программное обеспечение GraphPad, Сан-Диего).