劣性ジストロフィー性表皮水疱症（RDEB）ナンセンス変異患者に対するゲンタマイシン療法

局所および皮内ゲンタマイシン治療による C7 および AF 発現の評価 ゲンタマイシンの皮膚病変への局所適用: 市販のゲンタマイシン 0.1% 軟膏を 1 日 3 回、テガダーム閉塞下で 2 週間、対象の RDEB 皮膚びらんに適用します。 同様に、同じサイズの RDEB びらんに 1 日 3 回、軟膏コントロール ビークルを適用します。 この投与スケジュールは、CF 患者を対象とした成功した臨床試験に基づいており、副作用のない臨床効果が得られました.19 In vitro 細胞培養研究では、ゲンタマイシンの単回投与 (400 ug/ml) が、正常細胞で見られるレベルの 20 ～ 40% のレベルで C7 発現を誘導することを示しました (図 1A および 1B)23。 私たちの臨床試験では、実験用軟膏には、軟膏ビヒクル 1 ミリリットルあたり 1 ミリグラムのゲンタマイシンが含まれます。

ゲンタマイシンを RDEB 患者の皮膚の真皮上部に注射します。さらに、水ぶくれが形成されやすい領域内の傷のない無傷の皮膚の 2.0 cm x 2.0 cm のターゲット領域を特定し、市販の無菌ゲンタマイシン溶液 (生理食塩水中 40 mg/ml) を皮内注射します。 ）。 同様の対照領域に等量の生理食塩水を注射します。 各部位に 200 ul (8 ミリグラム) を 0 日目に 1 回、1 日目にもう一度注射します。 2 日間のそれぞれに 1 回の注射が部位に投与されます。 総投与量は 16 ミリグラムで、患者の真皮繊維芽細胞と基底ケラチノサイトに接触する真皮上部に注入されます。 我々が発表した in vitro リードスルー研究では、培養細胞の各 1 cm2 を 400 ugs/ml のゲンタマイシンに曝露し、細胞毒性のないリードスルー活性を示しました。 提案された皮内試験では、in vitro 投与量の約 5 倍の総投与量を使用します。

初期およびフォローアップパラメータ: あらゆる治療の前に、RDEB 患者は 3 つの部分に分割され、H&E 組織学、透過型電子顕微鏡法、および C7 発現の直接免疫蛍光法について評価される無傷の皮膚の 9 mm 剃毛生検を受けます。 RDEBびらんまたは水疱ができやすい領域の無傷の皮膚のゲンタマイシン治療の1および3か月後に、治療部位を生検し、組織学的、超微細構造的、およびC7発現評価を繰り返します。 免疫蛍光法 (IF) による DEJ での C7 発現の評価のために、5 ミクロンの凍結切片を、C7 の NC1 および NC2 ドメインに対する抗 C7 ポリクローナル抗体でプローブします。 ゲンタマイシン処理皮膚またはびらんの DEJ での C7 の NC2 ドメインの発現増加は、PTC リードスルーおよび全長 C7 の回復を示すため、この研究の 1 つの主要な「マイルストーン」として機能します。 生検の 3 番目の部分は超微細構造的に評価され、AF はコンピューター支援形態計測によって列挙されます。 これらの研究は、正常な AF の回復があるかどうかを評価します。 正常なヒト被験者の皮膚切片は陽性対照として機能し、車両制御部位からの皮膚切片は陰性対照として機能します。

患者の臨床評価: 皮膚びらん部位: 患者は、実験部位および対照部位のゲンタマイシンおよびビヒクル治療に対して盲検化される。 毎週、患者は部位を評価し、以下のように治癒を等級付けします。 0 = 浸食のサイズに変化なし。 +1 = 部分的な治癒と初期サイズよりも小さな浸食、および +2 = 傷の完全な閉鎖。

第二に、侵食のベースライン写真が生成され、侵食の面積がコンピューター支援の面積測定によって計算されます。 同一の評価は、治療後 1 か月および 3 か月で行われます。 したがって、この研究の 2 番目の「マイルストーン」は、ビヒクル コントロールで処理されたびらんと比較して、ゲンタマイシンで処理されたびらんの表面積が減少することです。

ゲンタマイシンの皮内注射によって処置されたＲＤＥＢの無傷の皮膚の評価：患者および治験責任医師は、実験領域および対照領域の処置に対して盲検化される。 毎週、患者はその領域を評価し、次のように評価します。 - 1 = その部位に新しい水ぶくれまたはびらんが形成されている、+1 = 新しい水ぶくれまたはびらんがない。 1か月目と3か月目のUSC訪問時に、サイトから生検が得られ、DEJでのC7の発現とAFの列挙について上記のように評価されます。

患者の安全性の評価: 患者は、ベースライン履歴、システムのレビュー (ROS)、バイタルサイン (体重を含む)、および治療前の 0 日目、1 日目 (治療の 1 日後)、および 1 と 3 の身体検査を受けます。 USCへの訪問中の月。 これらの同じ時点で、血液検査が行われ、全血球数、電解質、肝酵素、赤血球沈降速度、クレアチニン、および BUN が含まれます。 クレアチニンクリアランスも計算され、患者の治療部位の紅斑、浮腫、水ぶくれ、びらんが評価されます。 0日目、治療後1ヶ月および3ヶ月で、聴力検査の評価が行われます。 患者は、自宅で毎日 ROS アンケートに記入し、新しい兆候、症状、または ROS の変化について尋ねる USC 研究メンバーから毎週電話を受けます。

E. ゲンタマイシン誘導 C7 に対する免疫応答の特徴付け: 我々の研究患者はすべて、C7 の最も抗原性の高いドメインである NC1 ドメインを含む、より低いレベルの C7 を発現しています。 したがって、患者 B を除いて、患者の PTC を読み取ると、患者の免疫系によって抗原性と見なされるタンパク質が誘導されるとは思えません。 それにもかかわらず、ゲンタマイシンが非機能的ではなく機能的なC7種を生成することを願っています. この変化が免疫応答を引き起こし、抗 C7 抗体を生成するかどうかを評価するために、患者の血清をベースライン、1 か月、および 3 か月で取得し、塩分解 IIF および ELISA による抗 C7 抗体の評価を行います。 患者がC7に対する抗体を発症した場合、DIFによって皮膚にC7抗体沈着がないか調べます。