隐性营养不良性大疱性表皮松解症 (RDEB) 无义突变患者的庆大霉素治疗

用局部和皮内庆大霉素治疗评估 C7 和 AF 表达 庆大霉素局部应用于皮肤损伤：我们将在 Tegaderm 封闭下每天三次使用市售的庆大霉素 0.1% 软膏，持续两周，以达到目标 RDEB 皮肤侵蚀。 同样，我们将每天三次将软膏控制载体应用于类似大小的 RDEB 侵蚀。 该剂量方案基于 CF 患者的成功临床试验，该试验产生了无副作用的临床疗效。 19 在我们的体外细胞培养研究中，我们发现单剂量庆大霉素 (400 ug/ml) 诱导的 C7 表达水平是正常细胞中观察到水平的 20-40%（图 1A 和 1B）。 23 在我们的临床试验中，实验软膏每毫升软膏载体中含有 1 毫克庆大霉素。

将庆大霉素注射到 RDEB 患者皮肤的上层真皮中：此外，我们将在容易形成水泡的区域内确定未受伤的完整皮肤的 2.0 cm x 2.0 cm 目标区域，并皮内注射市售的无菌庆大霉素溶液（40 mg/ml 生理盐水） ). 类似的控制区域将被注射等量的盐水。 我们将在第 0 天和第 1 天再次向每个部位注射 200 ul（8 毫克）。 将在这两天的每一天对该部位进行单次注射。 总剂量为 16 毫克，注射到真皮上层，在那里它将接触患者的真皮成纤维细胞和基底角质形成细胞。 在我们发表的体外通读研究中，每 1 cm2 的培养细胞暴露于 400 ugs/ml 的庆大霉素，显示通读活性且无细胞毒性。 对于提议的皮内研究，我们将使用比体外剂量大大约 5 倍的总剂量。

初始和后续参数：在任何治疗之前，RDEB 患者将接受完整皮肤的 9 毫米剃须活检，将其分为 3 个部分，并评估 H&E 组织学、透射电子显微镜和直接免疫荧光 C7 表达。 在庆大霉素治疗 RDEB 糜烂或水疱易发区域完整皮肤后 1 个月和 3 个月，我们将对治疗部位进行活检，并重复组织学、超微结构和 C7 表达评估。 为了通过免疫荧光 (IF) 评估 DEJ 处的 C7 表达，将用针对 C7 的 NC1 和 NC2 结构域的抗 C7 多克隆抗体探测 5 微米冷冻切片。 C7 的 NC2 结构域在庆大霉素处理的皮肤或糜烂的 DEJ 处的表达增加将作为本研究中的一个主要“里程碑”，因为它表明 PTC 通读和全长 C7 的恢复。 活检的第三部分将进行超微结构评估，AF 将通过计算机辅助形态测量法进行计数。 这些研究将评估是否恢复了正常的 AF。 来自正常人类受试者的皮肤切片将作为阳性对照，而来自载体对照部位的皮肤切片将作为阴性对照。

患者临床评估： 皮肤侵蚀部位：患者将不知晓实验部位和对照部位的庆大霉素和载体治疗。 每周，患者将评估这些部位并按以下方式对其愈合进行分级： - 1 = 与初始大小相比侵蚀扩大； 0 = 侵蚀的大小没有变化； +1 = 部分愈合且侵蚀小于其初始大小，+2 = 伤口完全闭合。

其次，将生成侵蚀的基线照片，并通过计算机辅助面积测量法计算侵蚀面积。 将在治疗后 1 个月和 3 个月进行相同的评估。 因此，本研究的第二个“里程碑”是与载体对照处理的侵蚀相比，庆大霉素处理的侵蚀表面积减少。

通过皮内注射庆大霉素治疗的 RDEB 完整皮肤的评估：患者和研究者将对实验区和控制区的治疗不知情。 每周，患者将评估这些区域并将其分级如下：- 1 = 该部位有新的水泡或糜烂形成，+1 = 没有新的水泡或糜烂。 在 1 个月和 3 个月的 USC 访视中，将从这些部位获取活组织检查，并如上所述评估 C7 在 DEJ 的表达和 AF 的计数。

患者安全性评估：患者将在治疗前第 0 天、第 1 天（治疗后一天）以及第 1 天和第 3 天进行基线病史、系统回顾（ROS）、生命体征（包括体重）和体格检查他们访问南加州大学期间的几个月。 在这些相同的时间点，将进行血液检查，包括全血细胞计数、电解质、肝酶、红细胞沉降率、肌酐和尿素氮。 还将计算肌酐清除率，并评估患者治疗部位的红斑、水肿、水疱和糜烂。 在治疗后第 0 天、第 1 个月和第 3 个月，将进行听力测试评估。 患者将每天在家中完成一份 ROS 问卷，USC 研究成员每周都会打电话询问任何新的体征、症状或 ROS 变化。

E. 对庆大霉素诱导的 C7 的免疫反应的特征：我们的研究患者都表达较低水平的 C7，包括 NC1 结构域，这是 C7 最具抗原性的结构域。 因此，除了患者 B 之外，我们怀疑通过患者的 PTC 读取会诱导一种被患者免疫系统视为抗原的蛋白质。 尽管如此，我们希望庆大霉素能够产生功能性而非非功能性的 C7 种类。 为了评估这种变化是否触发免疫反应并产生抗 C7 抗体，将在基线、1 个月和 3 个月时获取患者血清，用于通过盐裂解 IIF 和 ELISA 评估抗 C7 抗体。 如果患者产生 C7 抗体，我们将通过 DIF 检查他们的皮肤是否有 C7 抗体沉积。