Gentamicinová terapie u pacientů s recesivní dystrofickou bulózní epidermolysis (RDEB) s nesmyslnou mutací

Vyhodnoťte expresi C7 a AF pomocí topické a intradermální léčby gentamicinem Lokální aplikace gentamicinu na kožní lézi: 3x denně aplikujeme komerčně dostupnou mast gentamicin 0,1% pod okluzí Tegaderm po dobu dvou týdnů na cílovou kožní erozi RDEB. Podobně aplikujeme kontrolní vehikulum masti třikrát denně na podobně velkou erozi RDEB. Toto dávkovací schéma je založeno na úspěšné klinické studii u pacientů s CF, která vedla ke klinické účinnosti bez vedlejších účinků.19 V našich studiích na buněčných kulturách in vitro jsme ukázali, že jediná dávka gentamicinu (400 ug/ml) vyvolala expresi C7 na úrovni 20-40 % té, která byla pozorována u normálních buněk (obrázek 1A a 1B).23 V naší klinické studii bude experimentální mast obsahovat 1 miligram gentamicinu na mililitr vehikula masti.

Injekce gentamicinu do vysoké dermis kůže pacienta s RDEB: Kromě toho identifikujeme cílové oblasti 2,0 cm x 2,0 cm neporaněné neporušené kůže v oblastech náchylných k tvorbě puchýřů a intradermálně vstříkneme komerčně dostupný sterilní roztok gentamicinu (40 mg/ml ve fyziologickém roztoku ). Do podobné kontrolní oblasti budou vstříknuty stejné objemy fyziologického roztoku. Do každého místa vstříkneme 200 ul (8 miligramů) jednou v den 0 a ještě jednou v den 1. Každý ze dvou dnů bude do místa podána jedna injekce. Celková dávka bude 16 miligramů vstříknutých do horní dermis, kde se dostane do kontaktu s dermálními fibroblasty a bazálními keratinocyty pacienta. V naší publikované in vitro read-through studii byl každý 1 cm2 kultivovaných buněk vystaven 400 ugs/ml gentamicinu, který vykazoval read-through aktivitu bez cytoxocity. Pro navrhovanou intradermální studii použijeme celkovou dávku přibližně 5krát vyšší než je dávka in vitro.

Počáteční a následné parametry: Před jakoukoli léčbou budou pacienti s RDEB podrobeni 9 mm holící biopsii neporušené kůže, která bude rozdělena na 3 části a vyhodnocena na H&E histologii, transmisní elektronovou mikroskopii a přímou imunofluorescenci na expresi C7. 1 a 3 měsíce po léčbě eroze RDEB nebo intaktní kůže v oblastech náchylných k puchýřům gentamicinem provedeme biopsii ošetřených míst a zopakujeme histologické, ultrastrukturální a C7 expresivní hodnocení. Pro hodnocení exprese C7 na DEJ imunofluorescencí (IF) budou sondovány 5mikronové kryosekce s anti-C7 polyklonálními protilátkami proti doménám NC1 a NC2 C7. Zvýšená exprese domény NC2 C7 na DEJ gentamicinem ošetřené kůže nebo erozí bude sloužit jako jeden hlavní "milník" v této studii, protože by to znamenalo přečtení PTC a obnovení C7 plné délky. Třetí část biopsie bude hodnocena ultrastrukturálně a FS budou vyčísleny pomocí počítačem podporované morfometrie. Tyto studie posoudí, zda došlo k obnovení normálních FS. Řezy kůže od normálních lidských subjektů budou sloužit jako pozitivní kontroly, zatímco řezy kůže z místa kontroly vehikula budou sloužit jako negativní kontroly.

Klinické hodnocení pacienta: Místa kožní eroze: Pacienti budou zaslepeni vůči ošetření gentamicinem a vehikulem na experimentálním místě a kontrolním místě. Každý týden pacienti hodnotí místa a hodnotí jejich hojení následovně: - 1 = zvětšení eroze ve srovnání s její původní velikostí; 0 = žádná změna velikosti eroze; +1 = částečné zhojení a menší eroze než původní velikost a +2 = úplné uzavření rány.

Za druhé budou generovány základní fotografie erozí a plocha erozí bude vypočtena pomocí počítačem podporované planimetrie. Stejné hodnocení bude provedeno 1 a 3 měsíce po léčbě. Proto bude druhým "milníkem" této studie zmenšení povrchových ploch erozí ošetřených gentamicinem ve srovnání s erozemi ošetřenými vehikulem.

Hodnocení neporušené kůže RDEB ošetřené intradermálními injekcemi gentamicinu: Pacienti a zkoušející budou zaslepeni vůči ošetření experimentální oblasti a kontrolní oblasti. Každý týden pacient vyhodnotí oblasti a ohodnotí je následovně: - 1 = nový puchýř nebo tvorba eroze v místě a +1 = žádné nové puchýře nebo eroze. Při návštěvách USC v 1. a 3. měsíci se z míst odeberou biopsie a vyhodnotí se, jak je uvedeno výše, na expresi C7 na DEJ a výčet AF.

Hodnocení bezpečnosti pacientů: Pacienti budou mít základní anamnézu, přehled systémů (ROS), vitální funkce (včetně hmotnosti) a fyzikální vyšetření v den 0 před léčbou a v den 1 (jeden den po léčbě) a poté v 1 a 3 měsíců během jejich návštěv v USC. Ve stejných časových bodech budou provedeny krevní testy, které zahrnují kompletní krevní obraz, elektrolyty, jaterní enzymy, rychlost sedimentace erytrocytů, kreatinin a BUN. Vypočítá se také clearance kreatininu a léčebná místa pacienta se vyhodnotí na erytém, edém, puchýře a eroze. V den 0, 1 měsíc a 3 měsíce po léčbě budou provedena audiometrická hodnocení. Pacienti budou denně doma vyplňovat dotazník ROS a každý týden jim bude telefonovat člen studie USC s dotazem na jakékoli nové příznaky, symptomy nebo změny ROS.

E. Charakterizace imunitních odpovědí na gentamicinem indukovaný C7: Všichni pacienti naší studie exprimují nižší hladiny C7 včetně domény NC1, která je nejvíce antigenní doménou C7. Proto, s výjimkou pacienta B, pochybujeme, že čtení PTC pacienta indukuje protein, který je imunitním systémem pacienta považován za antigenní. Nicméně doufáme, že gentamicin vytvoří funkční, spíše než nefunkční, druh C7. Aby bylo možné vyhodnotit, zda tato změna spouští imunitní odpověď a vytváří protilátky anti-C7, bude pacientovi odebráno sérum na začátku, 1 měsíc a 3 měsíce pro hodnocení protilátek anti-C7 pomocí salt-split IIF a ELISA. Pokud se u pacienta vytvoří protilátky proti C7, vyšetříme jeho kůži na depozita protilátek C7 pomocí DIF.